无创DNA阳性结果的验证和分析

燕凤　陈必良　徐慧　李春燕　徐盈　王德堂　郭芬芬　黎昱　郑娇　张建芳

(第四军医大学西京医院妇产科产前会诊中心，陕西 西安　710032)



无创DNA阳性结果的验证和分析

燕凤陈必良徐慧李春燕徐盈王德堂郭芬芬黎昱郑娇张建芳

(第四军医大学西京医院妇产科产前会诊中心，陕西 西安710032)

目的探讨无创DNA产前检测在产前诊断中的应用及价值。方法对2012年1月至2014年12月在西京医院妇产科做羊水穿刺的病人资料回顾性分析，发现因无创阳性做羊水穿刺的孕妇84例，用羊水染色体核型分析和FISH对其结果进行验证，并对两者不一致的结果进行电话随访。结果无创DNA84例阳性结果中21-三体48例，经羊水穿刺后确认为假阳性的有2例；18-三体11例，经羊水穿刺后确认为假阳性3例；13-三体4例，经羊水穿刺验证2例为假阳性；性染色体异常21例，经验证6例假阳性。结论孕妇外周血中游离胎儿DNA检测对21-三体检测准确率达95.8%，18-三体准确率73%，性染色体检出准确率71%，13-三体准确率50%。无创DNA是产前筛查21-三体的有效方法，对其他染色体异常的检测还需要进一步提高现有检测技术。

无创DNA产前检测； 异常结果； 核型分析；FISH

染色体非整倍体是指相对于人正常的46条染色体细胞中的一条或几条染色体数目增加或减少。目前，我国新生儿中染色体的发病率为1/60，其中21-三体、18-三体和13-三体是3种最主要的染色体非整倍体疾病。目前临床上对胎儿这几种病变产前诊断方法主要是通过B超引导下的羊水穿刺染色体核型分析，该技术检测所需时间长，穿刺过程又对胎儿有一定的风险。因此，寻求安全、准确、快速的无创产前检测技术是优生优育的基本需要。而胎儿染色体非整倍体的无创DNA产前检测通过采取孕妇静脉血，利用新一代DNA测序技术对母体外周血浆中的游离DNA 片段(包含胎儿游离DNA)进行测序，并将测序结果进行生物信息分析，可以从中得到胎儿的遗传信息[1]。本研究利用高通量测序技术检测孕妇外周血中的游离DNA，对其异常结果进行分析验证，旨在探讨无创DNA产前检测的临床应用价值。

1　材料与方法

1.1基本资料2012年1月至2014年12月在西京医院妇产科产前诊断中心因无创产前基因检测结果高风险的孕妇84例，自愿做羊水穿刺。使用染色体FISH和核型分析对无创结果进行验证并对每个孕妇的妊娠结局的进行随访。

1.2方法

1.2.1染色体制备B超引导定位，在无菌条件下，采用羊水专用穿刺针经腹部穿刺，抽取15 ml 羊水，经离心处理后接种于培养瓶内，置37℃、5%CO2恒温培养箱中培养，培养液为CHANG MEDIUM。经过换液后观察，镜下见小堆贴壁细胞长成大的克隆，并出现成对圆形透亮细胞，即可加入秋水仙碱收获细胞，经低渗、数次固定后常规制片，60～80℃烤片2小时。G显带染色分析。

1.2.2FISH检测未培养的羊水参照金菩嘉公司提供的操作步骤处理后进行FISH分析。每个杂交区至少数100个信号强、无重叠的杂交细胞。CSP18/X/Y探针和GLP13/21探针。阳性判断标准：GLP13/21、CSP18/X/Y探针至少计数100个细胞，非整倍体细胞比例>60%判为非整倍体。非整倍体细胞比例>30%为嵌合体。

1.2.3追踪随访对因无创阳性做羊水穿刺确诊的孕妇进行电话随访，随访其妊娠结局或出生后孩子的性别及出生后的健康状况。

2　结果

无创DNA84例阳性结果中，21-三体48例，18-三体11例，13-三体4例，性染色体异常21例。无创84例阳性结果无创提示48例21-三体经羊水染色体核型和FISH验证16例为21-三体，2例假阳性，假阳性率为4.2%。无创DNA检出18-三体11例经验证，3例假阳性，假阳性率为27%；无创13-三体高风险有4例经验证2例为假阳性，假阳性率为50%；无创DNA提示性染色体异常21例，经核型和FISH验证6例为假阳性，假阳性率为29%。

84例无创DNA结果异常的孕妇均对其进行了电话随访，其中染色体异常结果共71例引产70例，其中1例胎儿核型47,XXY，孕妇不想引产。因孕妇已发生3次胚胎停育此次自愿继续妊娠。其中13例无创DNA假阳性结果经染色体核型和FISH确认染色体核型正常的出生后电话随访后，家属均口述发育正常，健康，随访发现性别与染色体结果均一致。

3　讨论

在孕妇妊娠期开辟一种安全、可靠的产前筛查和产前诊断方法进行产前干预，是当前降低出生缺陷率最切实可行的方法。目前侵入式取样是产前诊断的金标准，但其存在一定的弊端[2]。因此针对妊娠高危人群进行多技术联合筛查和诊断，并根据病人自身情况作出合适的选择。胎儿染色体非整倍体无创基因检测技术它具有无创性、孕早期检测、相对血清学检查有很高的准确性。早孕期检测最主要的优势是早发现、早诊断、早干预，早期终止妊娠相对于中期引产更安全，还可以减少孕妇及家属的焦虑。但胎儿染色体非整倍体无创基因检测技术也有一定的局限性。首先该技术对目前检测的对象具有局限性，如母体本身染色体有异常( 如嵌合体， 21-三体平衡易位携带)，或者母体在孕前期接受异体输血、移植手术、干细胞治疗等，均对检测结果的准确性造成影响。并且孕妇孕周较大接受胎儿染色体非整倍体无创基因检测，检测的结果为阳性的，再接受羊水穿刺手术检查胎儿染色体，不仅增加病人的焦虑感，而且手术的风险也相对增加。因此不建议孕周超过24周的孕妇做无创基因检测。同时对于B超筛查如心脑血管系统异常，羊水量异常，明显器官、四肢异常及NT值异常的都不建议做无创基因检测。同时，双胎或多胎也不适合做无创基因检测。

影响无创DNA检测结果准确性的主要因素是孕妇外周血中胎儿游离DNA浓度。如果胎儿游离DNA浓度低于3%，检测结果的准确性将受到一定的影响[3,4]。研究表明，孕妇血清中游离DNA的含量受孕周和体重的影响。一般认为孕8周后孕妇外周血中游离胎儿DNA含量上升并稳定存在，孕期胎儿DNA含量在5%～50%，孕周越大DNA含量越高。无创DNA要求孕妇血清中游离DNA的含量占外周血中总DNA的50%以上，所以当孕妇由于各种原因导致自身游离DNA含量增高时孕妇血中胎儿游离DNA含量就相对偏低，这时就会导致检测失败。临床上引起孕妇自身DNA增高的原因有溶血、肿瘤等，另外也可能与个体差异有关。如孕妇自身体重指数肥胖，将增加循环血量而导致的稀释作用，使孕妇血液中胎儿游离DNA浓度降低[5]；孕妇自身游离DNA总量随体重指数按比例增加，而胎儿游离DNA不增加，即相当于胎儿游离DNA浓度降低[6]。

目前无创DNA技术被倾向于定位为T21、T18和T13等常见染色体非整倍体的筛查手段，受检者需要在给予充分咨询、知情同意的情况下自愿选择参加无创DNA检测。

对于本次研究无创结果与传统胎儿染色体方法进行分析发现，其中21-三体的准确率最高，其次为18-三体和性染色体，13-三体的准确率相对较差。研究发现18-三体、性染色体检测稳定性较差，受GC含量干扰所致[7]，Jiang F等[8]以标准Z-Score值为基础，通过改进染色体内标参照及计算方式，实现结果值变异系数小，一定程度上克服GC含量问题，提高和稳定了18-三体及性染色体检出率，而后继研究需要我们不断克服技术难题，并逐步推向临床。综上所述，胎儿染色体非整倍体无创基因检测技术对于诊断 21-三体综合征敏感性及特异性高，且因其为无创诊断，能有效缓解孕妇及家属的心理负担，故该检测方法可应用于唐氏综合症的早期产前诊断的新技术。

本次实验采用羊水核型分析和FISH技术对无创DNA进行验证，核型和FISH的符合率为99%，只有1例结果不一致，FISH结果为45,XO(35%)/ 46,XX，而核型结果为45,XO究其原因，这是因非整倍体细胞传代培养时较正常细胞生长速度快，原有的正常细胞比例就会在传代被稀释，如分子技术很易检测的45,XO/46,XX嵌合，经细胞培养后的核型分析为单纯45,XO。抽脐血验证后以FISH结果为准。FISH技术作为一个新的生物学诊断技术，可以对流产组织及产前诊断标本进行目标染色体数目异常的检测。本研究中通过和常规细胞遗传学方法的对比，FISH技术显现出独特的优势：①检测周期短，可以48～72小时出结果；②检测成功率高，本研究中成功率达到了100%；③取材时间不受孕周限制；④检测标本不受限；⑤操作简便；⑥FISH技术是低嵌合体检出判断的金标准。但是FISH技术也有一定的局限性，只能检测目标染色体数目异常，对染色体结构异常不能检测。因此FISH技术作为独立的产前诊断技术是有一定风险的。

因此对于国内目前的技术现状，做好孕妇产前诊断遗传咨询工作至关重要，根据孕妇的不同临床情况做出不同的检查项目。由于无创DNA 检测技术的一些局限性[9,10]，所以，目前的胎儿染色体诊断以细胞遗传学和FISH为主，无创DNA检测技术和基因芯片等技术可以对传统方法进行有益的补充，多种检测方法联合应用，以提高产前诊断的准确性、成功率。目前出现如此多的快速产前诊断技术，目的是促进优生医学的发展，而不应成为临床专业人员的障碍当然也提出了更高的要求，如何选择应用这些技术，如何达到最优的质量控制，如何做到检测前后最充分的咨询等。

[1]边旭明.胎儿染色体非整倍体的无创DNA产前检测[J].实用妇产科杂志,2013,29(5)：330-333.

[2]杨灿锋，石锦平，肖建平,等.无创DNA测序与传统方法在产前诊断应用中的比较[J].中国优生与遗传杂志，2014，22(11):27-28.

[3]Palomaki GE，Kloza EM，Lambert-Messerlian GM,et al.DNA sequencing of maternal plasma to detect Down syndrome: An international clinical validation study[J].GenetMed,2011,13(11):913-920.

[4]Palomaki GE,Deciu C,Kloza EM,et al.DNA sequencing of maternal plasma reliably identifies trisomy 18 and trisomy 13 as well as Down syndrome: an internationalcollaborativestudy[J].Genet Med,2012,14(3):296-305.

[5]Canick JA,Palomaki GE,Kloza EM,et al.The impact of maternal plasma DNA fetal fraction on next generation sequencing tests for common fetal aneuploidies[J].Prenat Diagn，2013,33:667-674.

[6]Vora NL，Johnson KL,BasuS,etal.A multifactorial relationship exists between total circulating cell-free DNA levels and maternal BMI[J].Prenat Diagn,2012,32:912-914．

[7]Chen EZ，Chiu RW，Sun H，et al.Noninvasive prenatal diagnosisof fetal trisomy 18 and trisomy 13 by maternal plasma DNA sequencing[J].PLos One,2011,6(7):e21791．

[8]Jiang F,Ren J,Chen F,et al.Noninvasive fetal trisomy ( NIFTY) test: an advancednoninvasive prenatal diagnosis methodology for fetal autosomaland sex chromosomal aneuploidies[J].BMC Med Genomics,2012,5:57

[9]Cavallotti D,Casilla G,Piantelli G，et al.Early complications ofprenatal invasive diagnostics ：perspective analysis[J].ActaBiomedAteneoParmense,2004,75Suppl 1:23-26.

[10]Fan HC,GuW,WangJ,et al.Non-invasive prenatal measurementof the fetal genome[J].Nature，2012,487(10):320-324.

编辑：宋文颖

ObjectiveTo investigate the clinical application value of non-invasive gene detection of aneuploidy in fetal as noninvasive prenatal diagnosis． MethodThe amniocentesis and karyotyping results in Xijing Hospital from January 2012 to December 2014 were retrospectively analyzed.The only indication for amniocentesis in these group of woman was positive NIPS (Non-invasive prenatal screening) results.84 case of positive NIPS results were required for validating by fetal karyotype analyzing through invasive procedures such as amniotic cavity.The NIPT result were compared with the fetal karyotyping and FISH for verification and analysis，telephone follow up after fetus birth for the chromosome result .ResultsAbnormal 84 cases did amniotic fluid puncture or umbilical cord puncture and chromosome karyotype analysis,48 cases of trisomy 21 were detected that 2 cases were false positive,11 cases of trisomy 18 were detected that 4 cases were false positive，4 cases trisomy 13 were detected that 2 cases were false positive，21cases abnormal in sex chromosome were detected that 6 cases were false positive.ConclusionsSequencing technology of free fetal DNA in pregnant women，detection of trisomy 21、trisomy 18 、trisomy 13 and abnormal in sex chromosome accuracy up to 95.8%,73%,71%and 50%.Non-invasive detection of DNA was an effective method of prenatal screening of trisomy 21，but on trisomy 18、13 trisomy and sex chromosome detection rate、accuracy rate to be further improved existing technologies.

noninvasive DNA prenatal testing；abnormal test results；karyotype analysis；FISH

10.13470/j.cnki.cjpd.2016.02.005

陕程(L03-09)

张建芳，E-mail：zhzhhao@163.com

R714.53

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2016-03-24)