姜黄素对转化生长因子-β诱导的A549细胞上皮间质转化的影响

汪玉琪来岳标姚庆华

姜黄素对转化生长因子-β诱导的A549细胞上皮间质转化的影响

汪玉琪1来岳标1姚庆华2

目的研究姜黄素对转化生长因子-β（TGF-β）诱导的肺腺癌A549细胞上皮间质转化（EMT）作用及可能机制。方法选取体外培养肺腺癌A549细胞采用MTT法检测姜黄素细胞抑制率。实验分对照组、TGF-β组（TGF-β 5ng/mL）、TGF-β+姜黄素组（TGF-β 5ng/mL+姜黄素10μmol/L）、姜黄素组（姜黄素10μmol/L）。采用Transwell细胞迁移及浸润实验检测各组的运动迁移和侵袭浸润的能力，免疫荧光和Western印迹法实验检测各组EMT相关标记物E-钙黏蛋白、N-钙黏蛋白和波形蛋白的表达水平与Wnt/β-catenin信号通路相关P-GSK3β、GSK3β、β-catenin、c-Myc蛋白以及Snail蛋白表达水平，同时检测Wnt/β-catenin抑制剂XAV939（1、2、4μmol/L）作用后EMT表达情况。结果MTT实验表明，10μmol/L姜黄素作用A549细胞24h和48h时，细胞增殖抑制率分别为（12.21±2.60）%和（21.33±3.25）%（P＜0.05）；TGF-β能显著促进细胞的运动迁移和侵袭浸润，下调E-钙黏蛋白的表达，上调波形蛋白及N-钙黏蛋白的表达，伴有P-GSK3β、β-catenin和c-Myc的表达增加以及Snail蛋白表达增加，GSK3β表达无明显变化，而姜黄素可以抑制TGF-β的作用（P＜0.05）。同时，XAV939对TGF-β诱导的EMT也有抑制作用。结论姜黄素可能通过抑制Wnt/βcatenin信号通路来抑制TGF-β诱导的A549细胞上皮间质转化。

肺腺癌A549细胞；上皮间质转化；姜黄素；Wnt/β-catenin信号通路

KEY WORDSA549 lung adenocarcinoma cells;epithelial-mesenchymal transition;curcumin;Wnt/β-cateninsignaling pathway

姜黄素已被证明具有抑制致癌物活化，调节细胞生存和凋亡，抑制血管生成和抗侵袭、抗转移作用[1-2]。目前已知姜黄素通过抑制Wnt信号通路的激活来抑制癌细胞的侵袭[3]。研究[4-6]报道，姜黄素通过抑制基质金属蛋白酶（matnix metalloproteinase，MMP）-2、MMP-9和血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）来抑制A549肺癌细胞的侵袭迁移。而姜黄素在肺癌细胞中的抗侵袭转移作用是否与其抑制上皮间质转化作用有关目前尚不明确。本实验通过体外研究，探讨姜黄素对肺腺癌A549细胞上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）的作用及可能的机制。

1 材料与方法

1.1 细胞与细胞培养 人肺腺癌细胞株A-549由浙江省胃肠重点实验室提供。细胞在37℃、5%CO2含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中培养，取对数生长期细胞进行实验。

1.2 药 物 姜黄素，Sigma公司。

1.3 试剂及仪器 TGF-β细胞因子购自PeproTech公司。抗体包括 P-GSK3β、GSK3β、β-catenin、cmyc、Snail、E-钙黏蛋白、N-钙黏蛋白、波形蛋白和β-actin及Wnt/β-catenin的抑制剂XAV939均为Sigma公司。6.5mm8μ孔径的聚碳酸酯膜Transwell试剂盒购自美国康宁，细胞侵袭浸润试剂盒购自Millipore。本研究所需的仪器设备由浙江省胃肠重点实验室提供。

1.4 方 法

1.4.1 MTT实验 取对数生长期的A549细胞调整浓度至4×104/mL，200μL/孔加入96孔板中。当贴壁细胞后，姜黄素（5～80μmol/L）加入到96孔板中进一步培养，每个药物浓度建立五个平行孔，培养12h、24h和48h后，每孔加MTT溶液（5mg/mL）20μL。继续孵育4h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液。每孔加150μL DMSO，振荡10min。选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，计算不同浓度姜黄素对A549细胞增殖抑制率，以姜黄素浓度为横坐标，增殖抑制率为纵坐标绘制细胞生长曲线。实验重复3次。

1.4.2 Transwell细胞迁移实验 实验分空白对照组、TGF-β组（TGF-β 5ng/mL）、姜黄素组（姜黄素10μmol/L）、TGF-β+姜黄素组（TGF-β 5ng/mL+姜黄素10μmol/L）；在姜黄素和/或TGF-β诱导A549细胞72h后，各组细胞均用PBS洗两遍，用含BSA的无血清培养基重悬。调整细胞密度至10×105/mL。取细胞悬液200μL加入Transwell上层小室，下层小室加入600μL含10%FBS的培养基，37℃5%CO2培养24h。用棉签轻轻擦去聚碳酯膜上表面的细胞。用4%多聚甲醛室温下固定 15min，0.1%结晶紫染色30min。附着于聚碳酯膜下表面的细胞在高倍镜下（× 200）随机取6个视野计数，取平均数。重复实验3次。

1.4.3 细胞浸润实验 将浓度为0.5g/L人工基质胶20mL铺于Transwell侵袭小室聚碳酯微孔膜（孔径8mm）的上表面，置37℃30min使其聚成凝胶。实验分成四组：空白对照组、TGF-β组（TGF-β 5ng/mL）、TGF-β+姜黄素组（TGF-β 5ng/mL+姜黄素10μmol/L）、姜黄素组（姜黄素10μmol/L）；Transwell上室中分别加入已消化重悬的各组用姜黄素和/或TGF-β预处理的细胞200μL（1×108/L），下室中加入600μL含10%FBS的培养基，培养24h后取出，PBS清洗，棉签去除滤膜上层细胞，将已经侵入并贴附于微孔膜下层的细胞固定并结晶紫染色，高倍镜下（×200）直接观察穿过膜的细胞数。随机计数6个视野，计数每个视野内穿过8mm微孔的细胞数。重复实验3次。

1.4.4 免疫荧光实验 取对数生长期A549细胞，将A549细胞分别接种于载玻片上，分成空白对照组、TGF-β组（TGF-β5ng/mL）、TGF-β+姜黄素组（TGF-β5ng/mL+姜黄素10μmol/L）、姜黄素组（姜黄素10μmol/L）；用TGF-β和/或姜黄素处理72h后进行免疫荧光分析。细胞处理72h后，用4%多聚甲醛固定15min，用PBS洗涤3次，并用0.1%的曲拉通穿孔15min。细胞用5%血清白蛋白孵育1h，阻断非特异性蛋白。加入一抗（E-钙黏蛋白、N-钙黏蛋白、波形蛋白抗体），4℃孵育过夜。用PBS冲洗3次后用有荧光素酶标记的羊抗兔的荧光二抗在37℃的恒温箱中孵育1h。染色的细胞被放置于载玻片上，使用OLS3100荧光显微镜进行观察（×400）。

1.4.5 免疫蛋白质印迹分析 取对数生长期的A549细胞，将A549细胞分别接种于培养瓶中，分成空白对照组、TGF-β组（TGF-β 5ng/mL）、TGF-β+姜黄素组（TGF-β5ng/mL+姜黄素10μmol/L）、姜黄素组（姜黄素10μmol/L）；用TGF-β和/或姜黄素处理72h。取10×105个对数生长期细胞加入0.5mL预冷细胞裂解缓冲液冰上孵育30min。离心收集上清，BCA法测定蛋白含量，100g/LSDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白，然后目的蛋白转到PVDF膜上。用含50g/L脱脂牛奶的TBST进行封闭1h，加入一抗（E-钙黏蛋白）（1:1000）、N-钙黏蛋白（1:1000）、Snai（l1:1000）、波形蛋白（1:1000）、β-actin（1:1000）、P65（1:1000）、P-P65 （1:1000）、IKB（1:1000）4℃孵育过夜，第2天用1∶5000的二抗（Santa Cruz）室温孵育2h后用增强型化学发光试剂盒进行显色，照相并分析结果。

1.4.6 统计学方法 使用SPSS软件统计分析，数据用（±s） 表示，采用One-wayANOVA检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 姜黄素抑制肺癌细胞增殖作用 5～80μmol/L的姜黄素作用12h、24h、48h后，A549细胞的生长受到不同程度抑制且呈浓度依赖性（图1，插页）。当10μmol/L姜黄素作用A549细胞24h和48h时，细胞增殖抑制率分别为（12.21±2.60）%和（21.33±3.25）% （P＜0.05）。根据结果，选择10μmol/L为进一步实验的药物作用浓度。

2.2 姜黄素抑制TGF-β诱导的A549细胞在体外的运动迁移和侵袭浸润 TGF-β组（TGF-β 5ng/mL）24h后侵袭穿膜的细胞数明显高于空白对照组；姜黄素组（姜黄素10μmol/L）24h后侵袭穿膜的细胞数明显低于TGF-β+姜黄素组（TGF-β5ng/mL+姜黄素10μmol/L）。TGF-β组细胞表现出比对照组更加活跃的迁移和侵袭能力（图2，插页），TGF-β的诱导能增强A549细胞的迁移和侵袭，而姜黄素可以抑制TGF-β对细胞迁移和侵袭能力的诱导作用。这些结果表明，姜黄素能抑制TGF-β诱导的肺腺癌A549细胞的EMT。

2.3 姜黄素抑制A549细胞上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）标志物的表达 与对照组相比，TGF-β处理后的细胞E-钙黏蛋白表达减少，而N-钙黏蛋白和波形蛋白的表达增加（图3A～D，插页）。姜黄素能抑制TGF-β诱导的A549细胞EMT，引起E-钙黏蛋白的增加而N-钙黏蛋白和波形蛋白的表达抑制（图3D，插页）。

2.4 姜黄素抑制A549细胞中Snail的表达 TGF-β和/或姜黄素处理A549细胞72h后，姜黄素对TGF-β诱导的肺腺癌A549细胞中的Snail蛋白的表达具有抑制作用（图4，插页）。

2.5 姜黄素通过Wnt/β-catenin信号通路抑制TGF-β诱导的EMT 肺腺癌A549细胞中P-GSK3β、GSK3β、β-catenin、c-Myc表达水平的变化可代表Wnt/β-catenin信号通路活性变化。研究结果表明，TGF-β能促P-GSK3β、β-catenin和c-Myc的表达，而GSK3β表达无明显变化，同时伴有E-钙黏蛋白的表达减少，波形蛋白和N-钙黏蛋白的表达增加；而姜黄素表现出对这种现象的一个抑制作用（图5A，插页）。Wnt/β-catenin的抑制剂XAV939（1、2、4 μmol/L）能逆转TGF-β诱导的EMT，伴随着Snail、N-钙黏蛋白、波形蛋白表达降低与E-钙黏蛋白的表达增加（图5B，插页）。显示Wnt/β-catenin信号通路在EMT过程中起着重要作用。

3 讨论

Snail基因与肿瘤的转移、肿瘤的分级、肿瘤的复发密切相关，并且已经发现Snail表达较高的患者预后差，生存率下降[7-8]。肺癌是全球癌症相关死亡原因中最常见的原因之一。大多数肺癌患者被诊断时已经发生了远处转移[9]。因此，有效的肺癌治疗必须包括转移性疾病的治疗。EMT被公认为是胚胎发育的基本过程，目前被认为是上皮来源的恶性肿瘤细胞获得迁移和侵袭能力的重要生物学过程[10-12]。EMT促进肿瘤细胞从起源处转移到远处器官的过程是通过一个特定遗传程序的激活[13]。因此，使用阻止或逆转这一过程的药物是一种很有前途的治疗策略。而Wnt/β-catenin信号通路在Snail依赖的EMT中非常重要[14-15]。TGF-β作为骨形态发生蛋白属于β蛋白超家族，涉及多个生物过程包括细胞增殖，凋亡和肿瘤的发生[16]。TGF-β和Wnt/β-catenin信号通路通过Smad蛋白相互联系，特别是TGF-β抑制蛋白Smad7，有报道显示其通过选择性下调游离的βcatenin而上调与E-钙黏蛋白连接的β-catenin[17-19]。

姜黄素具有抑制致癌物质活化和血管生成、调节细胞生存和凋亡的作用，具有抗侵袭和抗转移的作用[2]。研究[4-6]报道，姜黄素通过抑制MMP-2、MMP-9和VEGF来抑制A549肺癌细胞的侵袭迁移。但是这些强大的抗转移效应尚未与EMT相联系。最重要的是该研究是第一次证明姜黄素能在体外抑制TGF-β诱导的肺腺癌A549细胞的EMT，将姜黄素的抗肿瘤转移与EMT相联系。

本研究利用TGF-β诱导A549细胞72h为细胞模型来研究姜黄素对EMT的抑制作用。通过免疫荧光和免疫蛋白印迹法表明姜黄素能影响TGF-β诱导的EMT标志物表达。Transwell细胞运动迁移和侵袭浸润实验证明姜黄素可抑制肿瘤细胞的运动迁移和侵袭浸润。进一步的实验表明，Wnt/β-catenin信号通路是TGF-β诱导肺腺癌A549细胞EMT中的重要信号通路。而姜黄素能抑制Wnt/β-catenin信号通路的活性来抑制EMT。另外E-钙黏蛋白及波形蛋白这两个EMT过程中重要的标记物与Snail之间关系密切[20-21]。许多具有肿瘤预防作用的物质已被证实通过Snail转录因子抑制EMT[22]。本研究证实姜黄素能抑制Snail的表达，抑制肿瘤细胞的运动迁移和浸润侵袭。

EMT不仅促进肿瘤的侵袭和转移的过渡，还可介导细胞的耐药性[6]。姜黄素可能会提高这些药物的疗效。另外，EMT也会对放疗的敏感性产生影响，包括促进放疗后的纤维化和放疗后的肿瘤相关转移[23]，而这可能与E-钙黏蛋白的表达下调有关[24-25]。因此，姜黄素可能通过抑制细胞的EMT逆转肺癌细胞对化疗和放疗的不敏感，改善患者预后。综上所述，本研究表明姜黄素对肿瘤侵袭能力的影响与抑制细胞的EMT过程是相关的，其通过抑制Wnt/β-catenin信号通路的活化来调节下游基因的表达和细胞的EMT。这个结果为姜黄素治疗肺癌的应用提供了理论基础。

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（收稿：2015-06-30 修回：2015-09-02）

Effect of Curcumin on Epithelial-Mesenchymal Transition Induced by TGF-β in A549 lung adenocarcino－ma cells

niversity,Hangzhou(310053),China;2 Department of Integrated Western Medicine and Chinese Medicine,Zhejiang Cancer Hospital,Hangzhou(310022),China WANG Yuqi1,LAI Yuebiao1,YAO Qinghua2. 1 First Clinical College of Zhejiang Chinese Medical U－

ObjectiveTo investigate the effect of curcumin on transforming growth factor β（TGF-β）-inducedepithelial-mesenchymal Transition（EMT）in A549 lung adenocarcinoma cells and the underlying mechanism.MethodsHuman A549 lung adenocarcinoma cells was used to detect inhibition rate of curcumin by MTT assay.The studywas divided into 4 groups:control group,TGF-β group（treated with TGF-β5ng/mL）,TGF-β+curcumin group （treated with TGF-β 5ng/mL and curcumin 10μmol/L）,curcumingroup（treated with curcumin 10μmol/L）.Transwell and cell invasion assays were used to detect the movement and infiltration ability of each group.Immunofluorescence and Western blot analysis were used to detect the expression level of EMT related markers such as E-cadherin,N-cadherin and vimentin and the expression level of Wnt/β-cateninsignaling pathway-related P-GSK3β, GSK3β,β-catenin and c-Mycand Snail protein.The expression level of EMT effected by Wnt/β-catenin inhibitorXAV939 was also determined.ResultsMTT assay showed that 10μmol/Lcurcumin inhibited the proliferation of A549 cells along with the increase of the treatment time（24h:12.21%±2.60%;48h:21.33%±3.25%;P＜0.05）. TGF-β significantly stimulated cell movement and invasion,reduced the expression of E-cadherin,increased the expression of vimentin and N-cadherin,promoted the expression of P-GSK3β,β-catenin,c-Myc proteins and Snail,but made little changes in total of GSK3β.These effectsof TGF-β on A549 cells werecompletely blocked by curcumin（P＜0.05）.XAV939reversed TGF-β-induced EMT.ConclusionCurcumin inhibited EMT induced by TGF-β in A549 lung adenocarcinoma cells probably through inhibiting the Wnt/β-catenin signaling pathway.

1浙江中医药大学第一临床医学院（杭州 310053）；2浙江省肿瘤医院中西医结合科（杭州 310022）

姚庆华，Tel：13588899111；E-mail：danfer1001@163.com