北京家族结核分枝杆菌鉴定方法的研究进展

郭立娟 黄海荣 高飞 王桂荣



·综述·

北京家族结核分枝杆菌鉴定方法的研究进展

郭立娟 黄海荣 高飞 王桂荣

结核病仍是严重威胁人类健康的全球公共卫生问题之一。北京家族结核分枝杆菌是我国大部分地区流行的主要菌株。作者论述了插入序列IS6110-限制性片段长度多态性(IS6110-RFLP)、间隔区寡核苷酸分型(Spoligotyping)、长序列多态性(LSP)以及单核苷酸多态性(SNP)等多种北京家族结核分枝杆菌分型技术，并讨论了各技术的优缺点，以便对北京家族结核分枝杆菌的鉴定提供可靠依据。

分枝杆菌，结核； 基因型

结核病(tuberculosis, TB)是伴随人类历史最长的疾病之一，也是全球由单一致病菌导致死亡人数最多的疾病，已成为全球重大公共卫生问题和社会问题。我国是全球22个结核病高负担国家之一，结核病患者例数仅次于印度，居世界第二位[1]；我国也是全球27个耐多药结核病(multiple drug resistant tuberculosis, MDR-TB) 高负担国家之一。因此，我国结核病的防治工作任重道远。结核分枝杆菌北京家族是van Soolingen 等[2]1995年首次发现并报道的，它是利用插入序列IS6110-限制性片段长度多态性(IS6110-RFLP)和间隔区寡核苷酸分型(Spoligotyping)方法对中国北京地区结核分枝杆菌进行分型研究，发现超过85%的菌株均属于这个家族，故命名为北京家族。这些菌株具有高度相似的IS6110酶切片段多态性图谱，Spoligotyping分型显示这类菌株缺失了1～34个间隔区。随后，在东亚的其他国家也发现有很高的流行。早期在美国广泛传播的耐多药菌株W菌株根据Spoligotyping型别，也被鉴定为北京家族菌株，而北京家族菌株因此又被称为“W/Beijing菌株”。近年来，许多对结核分枝杆菌的研究中，发现北京基因型菌株是一簇基因型相似的菌株的集合，统称为“北京基因型家族株”，即北京家族。

研究显示，根据不同的基因特征，可将北京家族进一步分为许多亚系，依此区分不同的北京家族株成员。从而深入地了解了北京家族的起源及分子进化。基因大片段多态性(LSP)分析有其特定的优势，并已运用到众多研究中。LSP一般是由基因缺失和重排所致，通常是不可逆的唯一事件，可作为Mtb基因分型及构建系统进化史的分子标志。Brosch等[3]发现大多数缺失并不是一件独特事件的结果，而是一系列缺失事件留下的痕迹，其在追踪传播中是非常有效的手段，目前最常用的片段引物主要有氨基末端片段(N-terminal fragment，NTF)、差异区域(region of difference,RD)105、RD181、RD150、RD142[4-5]。全球的北京家族可根据RD181、RD150、RD142等3个大片段缺失进一步划分为4个亚型。由于RD142和RD150在多个地区的北京家族菌株中多态性很低甚至没有多态性，这3个长片段多态性(large sequence polymorphism，LSP)位点并不能有效地研究不同地区北京家族菌株的群体结构。刘彬彬[6]在对290例北京家族结核分枝杆菌的研究中，通过RD105、RD181和NTF位点的鉴定，北京家族结核分枝杆菌主要表现为4个亚群，最大的一个亚群基因型特征表现为RD105和RD181缺失，并且为现代型。这提示，在北京家族的进化中，现代型北京家族并且RD105、RD181缺失，可能是主导进化前进过程的一个重要的分支，可将RD181缺失可作为探讨进化进程的一个关键信号。这需要在以后的研究中对其进行更深入的研究。另外，根据RD181与NTF区域的插入有无，依此区分古老型与现代型北京家族有一定的区别。

最新研究发现，北京家族菌株已蔓延全球各个地理区域，亚洲最高达44.7%，欧洲和非洲分别为27.9%和12.5%，美洲最低(8.9%)[7]。大量的临床和流行病学研究发现，北京家族结核分枝杆菌可能与耐多药[8-9]、高致病性有关，从而导致传播[10]和感染活动性疾病的概率增加[11]，其已达到全球分离结核分枝杆菌菌株的13%，全世界有1/3的结核分枝杆菌由北京家族结核分枝杆菌引起，其已成为世界第二大流行的结核分枝杆菌菌株；它是遗传上高度保守，具有在人群中引起发病的遗传学优势，其在世界范围内的广泛传播，对公共卫生构成潜在威胁。因此，研究快速简单的检测北京家族结核分枝杆菌的方法是很有必要的。目前，应用较多的主要包括Spoligotyping、IS6110-RFLP、可变串联重复序列(VNTR)、LSP、单核苷酸多态性(SNP)等。利用这些方法可将北京家族结核分枝杆菌分为不同的亚型，如：Mokrousou等[12-13]依据北京菌株基因组NTF区域IS6110插入序列的多态性而将其分为古老和现代2个亚型；Luo等[14]采用8个SNP位点结合VNTR-15的复合分型方法。首先将北京谱系Mtb分为最近共组年代不同的8个亚谱系，在此基础上，再行VNTR-15基因分型；Schurch等[15]也推出了51个SNP位点，将北京谱系结核分枝杆菌分为现代和古代2个亚谱系。这些工作均为深入研究北京家族结核分枝杆菌的流行特征奠定了基础。笔者对北京家族结核分枝杆菌的鉴定方法及其研究进展综述如下。

一、 IS6110-RFLP技术

IS6110-RFLP是将插入序列IS6110与限制性片段长度多态性技术相结合的一种基因分型技术。IS6110插入序列是由Thierry等[16]于1990年最先发现并报道的，其全长1355 bp，隶属于IS3家族，并且只存在于结核分枝杆菌基因组中。这种插入序列广泛分布于结核分枝杆菌的基因组中，在不同的临床分离株中其重复次数也比较宽泛，为0～26个重复[17-18]。根据IS6110在不同菌株中的数目和位置不同，从而进行基因分型。

1993年，van Embden等[19]介绍了IS6110-RFLP分型法的标准操作方法，现已广泛应用于结核病分子流行病学的研究领域中。具体方法是首先提取结核分枝杆菌全基因组 DNA，然后利用限制性内切酶PuvII 在相应的 IS6110 酶切位点进行酶切，琼脂糖凝胶电泳分离酶切后的 DNA 片段，经Southern Blotting(DNA印记法)将分离后的 DNA 片段转印到尼龙膜上，与标记的特异性DNA探针进行杂交显色，最终于尼龙膜上形成特异性的DNA图谱，即所谓的“DNA指纹”。该方法分辨率高、具有很强的菌株鉴别能力，被国际上推为结核分枝杆菌基因分型技术的“金标准”，至今仍是实验室研究热点之一。例如，Roychowdhury等[20]在对1377株结核分枝杆菌进行以IS6110为单位的新一代测序技术 (next-generation sequencing，NGS)分析时发现，这些菌株包括了全球7大谱系菌株，并且发现特定的谱系中IS6110的拷贝数和插入区域均是保守的，并且根据IS6110在不同谱系中的拷贝数及位置不同，可作为谱系鉴定的进化标志。

此分型方法可以用于鉴定北京家族菌株[4]，即将菌株的RFLP图谱与19个有代表性的北京家族菌株的IS6110-RFLP图谱(http:www.wadsworth.org/rflp/RFLP.html)相比较，如果与某一菌株谱带相似性>80%，就可以定义为北京家族菌株。Mokrousov等[12]于2002年在对俄罗斯流行的北京家族菌株研究中发现，可根据基因组NTF区域IS6110插入多态性分为N和NTF∶IS6110两型，N型在NTF区无IS6110插入序列，反映了祖先菌株在该位点的状态，所以又被称为“古老型”北京家族菌株；NTF∶IS6110型则在该区域都存在1个或2个IS6110转座子序列，所以又被称为“现代型”北京家族菌株[12-13]。通过比较发现，“现代型”北京家族菌株的IS6110 RFLP图谱与早期Van Soolingen等[2]在北京地区鉴定的北京菌株及与在美国流行的W菌株的RFLP图谱有很高的相似度(80%左右)；而“古老型”北京家族菌株间的RFLP图谱则存在较大差异，其与“现代型”北京家族菌株RFLP图谱的差异也较大。这说明“古老型”北京家族菌株间遗传差异较大，而“现代型”北京家族菌株间则有极高的遗传相似性。

对于已有RFLP图谱的菌株，可以利用IS6110-RFLP鉴定方法进行回顾性研究，但由于操作繁琐，这种方法并不适用于大批量快速检测。因此，在实验室研究中并不常规应用此方法来进行北京家族菌株的鉴定。

二、Spoligotyping技术

Spoligotyping技术是基于结核分枝杆菌基因组中的直接重复(direct repeats，DR)序列建立起来的基因分型技术。DR序列存在于所有结核分枝杆菌的基因组中，该序列包括多个36 bp的保守DNA序列和多个特异的34～41 bp的间隔序列。由于不同的结核分枝杆菌DR序列中特异性间隔序列的个数及位置不同，通过对间隔序列进行检测即可将不同的结核分枝杆菌区分开来[21]。1997年Kamerbeek等[22]设计了一种独特的PCR方法，该方法首先采用PCR扩增结核分枝杆菌的DR序列，然后与固定在膜上的43条间隔序列特异性探针进行杂交，再通过增强化学发光法(ECL)检测[23]，得到较为特异的结果。结果判读杂交阳性即间隔区存在，用“1”表示，阴性即间隔区缺失，用“0”表示，这样每间隔区的检测结果就获得0或1的数字编码，然后用BioNumerics软件进行结果分析。通过Spoligotyping可将全球流行的结核分枝杆菌分为60多个主要的家族以及千百种无法进行归类的新基因型。目前国际上已建有Spoligotyping数据库(SploDB4)，该数据库共收录了世界范围内122个国家的 39 295株结核分枝杆菌分离株的Spoligotyping图谱[24]。

1995年van Soolingen 等[2]采用Spoligotyping技术进行结核分枝杆菌基因分型的研究时发现，中国北京及其周边地区存在一大群具有显著相似遗传特征的结核分枝杆菌，主要特征是43个寡核苷酸探针中1至34位呈阴性反应，即命名为北京家族菌株。且根据Spoligotyping特征性图谱分析，可将北京家族菌株分为“典型”(43个特征性间隔序列中1～34位缺失，35～43位9个间隔序列存在)和“非典型”(不完全与第35～43间隔区杂交，杂交区的数目少于9个)两大类。近年来，利用Spoligotyping进行基因分型的研究很多。例如，Flores-Trevio等[25]利用Spoligotyping对墨西哥哈里斯科州的68株结核分枝杆菌进行基因多态性研究时，发现了一个罕见的与高耐药有关的北京家族基因型(SIT406)，这是在拉丁美洲的首次发现；Wang等[26]利用Spoligotyping对来自青海的251株结核分枝杆菌进行基因分型时，发现菌株呈现基因多态性。经聚类分析，可被分为2大基因群，即北京家族菌株(73.7%)和非北京家族菌株(26.3%)。但应用该分型技术不能区分不同的北京基因型菌株，且该方法操作复杂、耗时较长，需要多种仪器设备，不适合基层实验室及大规模的推广应用。

三、LSP技术

LSP是基于结核分枝杆菌基因组DNA中的RD而建立的结核分枝杆菌谱系鉴定技术。LSP一般是由基因缺失和重排所致，并且这些RD缺失一旦发生，大部分会稳定遗传到子代菌株基因组中，因此，可作为结核分枝杆菌基因分型及构建系统进化史的分子标志。通过该技术可将全球的结核分枝杆菌分为6大谱系[27]，即环印度洋系(L1)、东亚谱系(L2)、东非-印度谱系(L3)、欧美谱系(L4)、西非-1系(L5)、西非-2系(L6)，北京家族隶属于东亚谱系。且每个谱系结核分枝杆菌均与对应的地理人群存在着一定联系[28-30]。此外，Tessema等[31]在对来自埃塞俄比亚西北部的244株结核分枝杆菌进行VNTR和Spoligotyping研究时，发现了一个新的谱系，定义为L7。研究发现，根据TbD1缺失与否可将6大谱系分为古老与现代菌株，即环印度洋系、西非-1系、西非-2系(L1、L5、L6)，由于存在TbD1，被认为是古老菌株，而其他谱系由于缺失TbD1则被认为是现代菌株[3]。LSP 与 Spoligotyping 在鉴定结核分枝杆菌主要谱系(或家族)上具有一定程度的一致性，如经 LSP 鉴定的东亚谱系与经 Spoligotyping 鉴定的北京家族结核分枝杆菌呈高度一致，欧美谱系与 T 家族、S家族、X 家族、Haarlem、LAM 家族相一致，东非-印度谱系与 CAS 家族相一致，环印度洋谱系与 EAI 家族相一致[32]。近年来，利用LSP技术对结核分枝杆菌的研究越来越多。例如，Faksri等[33]利用LSP技术对来自泰国的256株结核分枝杆菌进行谱系分类，可得到环印度洋系谱系(70%)、北京谱系(23%)和欧美谱系(7%)三大谱系，并且发现北京家族谱系与耐药和低龄化相关。LSP采用普通PCR 即可完成基本操作(个别RD片段需要进行测序等辅助检查技术)，针对某一特定RD片段，在其序列两端设计合成引物，PCR扩增得到相应产物片段，电泳鉴定产物片段长度，若该RD片段缺失，则产物片段相对较短，即可鉴定为某一谱系结核分枝杆菌。

2005年，Tsolaki等[5]在比较结核分枝杆菌标准株H37Rv与北京家族菌株LSP的差异过程中发现，RD105在所有H37Rv菌株中都存在，而在所有北京家族菌株中全部缺失，提出了RD105缺失基因可以作为“北京家族”菌株鉴定的一个非常有价值的分子标记。研究表明，RD105缺失基因检测法对北京家族菌株的鉴定结果与金标准Spoligotyping基本一致，敏感度和特异度高达100%，且该方法操作简便、快速、费用低廉、结果准确可靠，逐渐成为对北京家族菌株进行鉴定的首选筛选方法[34]。另外，全球的北京家族菌株可被另外3个大片段缺失(RD181、RD142、RD150)进一步划分为4个亚型。其中，根据RD181的缺失与否，可将北京家族菌株分为“古老型”和“现代型”。但由于RD142和RD150在多个地区北京家族菌株中的多态性很低甚至没有多态性，这3个LSP位点并不能有效地研究不同地区北京家族菌株的群体结构[35]。

四、单核苷酸多态性(single nucleotide polyrnorphism，SNP)技术

SNP技术主要是指基因组水平上由单个核苷酸变异引起的基因组DNA序列多态性，这种多态性包括单个碱基的转换、颠换、插入和缺失等4种形式，但研究中通常认为SNP仅包括转换和颠换两种形式。它可分为同义SNP和非同义SNP两类，这些SNP位点与微卫星等重复序列多态性相比，具有如下优点：(1)位点丰富：SNP位点几乎遍及整个基因组，它是人类可遗传的变异中最常见的一种；(2)遗传稳定：与其他重复序列多态性标记相比，具有更高的遗传稳定性；(3)疾病相关性：SNP突变可影响蛋白质结构或表达，从而引起表型变异、耐药、疾病易感性等。因此，SNP可被用于结核分枝杆菌菌种鉴定、进化分析，以及疾病相关基因等方面的研究。

SNP有多种鉴定方法，但依据其基本原理可分为两大类：一类是DNA测序相关方法，主要有全基因组测序和目的基因片段测序两种；另一类是基于PCR扩增的非DNA测序方法，如实时定量PCR(real-time PCR，RT-PCR)、PCR限制性片段长度多态性(PCR-RLFP)、PCR单链构象多态性(PCR-SSCP)、基因芯片(基因探针)检测等。北京家族结核分枝杆菌由于其在致病性、耐药及传播方面的独特性，引起了人们利用SNP位点对其进行研究的兴趣。Homolka等[36]研究发现，Rv2629等位基因中的A191C突变是北京基因型的生物学标志。随后，Alonso等[37]利用该SNP标志建立了一种与RT-PCR结合的高分辨率熔解(high-resolution melting)实验，可快速区分北京家族与非北京家族的菌株。另外，Jiang等[38]利用SNP技术在对来自中国的180株结核分枝杆菌人类 T细胞表位中Ag85抗原复合体分析时发现，Ag85B中的C714A基因位点可能是北京家族系统进化的非常有价值的分子标记。此外，Mestre等[39]通过复制、重组、修复相关3R基因(replication，recombination和 repair)的单核苷酸多态性位点分型，可将我国的北京菌株进一步分为7种亚型，并且发现Bmyc10亚型在群体中占主导地位，约占所有北京菌株的80%。通过比较发现，Bmyc10亚型与根据NTF区域差异定义的“现代北京家族”本质上是同一类菌株，但SNP分型对北京家族菌株的定义更为细致。此外，罗涛[40]从我国11省份收集并鉴定的1385株北京菌株3R基因的8个 SNP位点进行分型，这些菌株共被分为8个亚型，并且根据菌株在mutT2基因58号密码子的突变情况，Bmyc10、Bmyc13及Bmyc210属于“现代型”北京家族菌株，而Bmyc2、Bmyc6、Bmyc4、Bmyc25及Bmyc26属“古老型”北京家族菌株。并且和VNTR等基因分型相比，SNP具有可准确定义菌株进化地位的优势。

五、分枝杆菌散在重复单位-数目可变串联重复序列(Mycobacterium interspersed repeats units-variable number of tandem repeats，MIRU-VNTR)技术

MIRU-VNTR技术是基于结核分枝杆菌基因组中的 VNTR 位点而建立起来的结核分枝杆菌基因分型方法。VNTR 又称“小卫星 DNA” (mini-satellite DNA)，是一种重复 DNA 小序列，每个特定的 VNTR 位点由两部分组成，即中间特异的“核心区”和两侧保守的“侧翼区”。核心区含有至少 1 个以上称之为“重复单位”(repeat unit)、并以串联形式存在的 DNA 短序列，一般该重复单位的碱基序列不变，但在不同的结核分枝杆菌中该重复序列串联在一起的数目是可变的[41]。MIRU-VNTR 就是针对结核分枝杆菌基因组 DNA 中的多个 VNTR 位点，对其进行组合，通过对相应位点进行重复单位数目的计算，实现对不同结核分枝杆菌的基因分型。该方法的基本原理是基于 PCR 的扩增方法， 挑选适当的 VNTR 位点，PCR 对该位点进行扩增，琼脂糖凝胶电泳分析 PCR 产物大小，并根据已知的该位点“重复单位”大小及两侧的保守侧翼区(flank region)大小对该位点进行重复单位个数的计算，相应结果用数字表示。对多个 MIRU-VNTR 位点进行组合分析，最终得到一组由不同数字组成的 MIRU-VNTR 基因型，从而实现了不同结核分枝杆菌的基因分型[42]。该方法较 IS6110-RFLP 操作简便，对 DNA含量及质量要求较低，不需预先培养结核分枝杆菌，也不需结核分枝杆菌的全基因组 DNA；结果以数字化形式表现，便于分析及不同实验室之间进行比较；分辨率略低于 IS6110-RFLP，但明显高于 Spoligotyping，因此受到了结核病分子流行病学研究领域的广泛重视。

但VNTR分型法与北京家族结核分枝杆菌识别的关系尚不清楚。虽然 15 位点和 24 位点 MIRU-VNTR 组合在结核病分子流行病学研究领域发挥了重要的作用，但是大量的研究表明，对于北京家族结核分枝杆菌高流行的地区(如中国)来说，这两种组合并不是最佳的基因分型位点组合[43-44]，主要是由于北京家族结核分枝杆菌菌株间的遗传相似性较高的原因[14]。因此，Iwamoto 等[45]对北京家族结核分枝杆菌进行深入研究，组建了一套 18 位点 MIRU-VNTR 组合用于对北京家族结核分枝杆菌进行基因分型。Murase 等[46]重新组合了12 个 MIRU-VNTR 位点，发现该 12 位点 MIRU-VNTR 对北京家族结核分枝杆菌的分辨能力优于标准 15 位点MIRU-VNTR，接近 24 位点 MIRU-VNTR。Luo 等[47]为推行出一套最适合中国地区流行的结核分枝杆菌基因分型的 MIRU-VNTR 位点组合，对收集自中国6个省的1362 株结核分枝杆菌进行了 25 个 MIRU-VNTR 位点的分辨能力的评价，最终组建出适合于我国结核分枝杆菌基因分型的 9 个 MIRU-VNTR 位点组合，以及用于进一步区分成簇菌株的 3 个 VNTR高变位点。刘彬彬[6]利用15位点对北京家族菌株的研究中，发现MLVA分型在北京家族进化的探讨中也可起到一定的标识作用，并筛选出ETRD、MIRU26、Mtub21和Mtub30这4个位点，可以作为提供北京家族菌株系统进化的信号；金嘉琳等[48]在利用12位点VNTR进行北京家族菌株进行分型中，发现在北京家族菌株中分辨率最高的是MIRU26位点，最低的为ETR-B位点；所以针对特定地区和人群，应选取分辨率较高的VNTR位点进行北京家族的微进化研究，从而能为北京家族菌株分子流行病学框架的构建、菌株进化研究和临床菌株的基因型分析提供帮助。

六、小结

结核病分子流行病学研究是集分子生物学、临床医学及流行病学几种学科的联合应用，它从基因水平研究结核病的病原分子特征、遗传变异机制、耐药机制、人群中传播规律及危险因素等。分子流行病学的核心是分子分型技术，它能克服传统流行病学不足，对结核病暴发流行时追踪传染源、检测结核病的传播、区别内外源性感染、多克隆或单克隆感染、识别耐药菌株感染流行，以及分析某一地区流行的结核分枝杆菌的群结构特征等方面的研究都具有十分重要的意义[49]。

在对北京家族结核分枝杆菌进行鉴定的各种分型方法中，IS6110-RFLP、Spoligotyping和VNTR技术是国际上进行结核病流行病学研究最常用的方法，并且在结核病的防控中发挥了重要作用，目前都已有标准操作方法；LSP和SNP是新兴的分子分型技术，随着对这些分型技术的深入研究，北京家族结核分枝杆菌的鉴定会更加简便、快速和细致。

[1] World Health Organization. Global tuberculosis report 2014.Geneva:World Health Organization,2014.

[2] van Soolingen D, Qian L, deHaas PE,et al. Predominance of a single genotype ofMycobacteriumtuberculosisin countries of east Asia.J Clin Microbiol,1995,33(12):3234-3238.

[3] Brosch R,Gordon SV,Marmiesse M,et al.A new evolutionary scenario for theMycobacteriumtuberculosiscomplex. Proc Natl Acad Sci U S A,2002,99(6):3684-3689.

[4] Sreevatsan S,Pan X,Stockbauer KE,et al. Restricted structural gene polymorphism in theMycobacteriumtuberculosiscomplex indicates evolutionarily recent global dissemination.Proc Natl Acad Sci U S A,1997,94(18):9869-9874.

[5] Tsolaki AG，Gagneux S，Pym AS，et al．Genomic deletions Classify the Beijing/W strains as a distinct genetic lineage ofMycobacteriumtuberculosis.J Clin Microbio1,2005,43(7):3185-3191．

[6] 刘彬彬.北京地区结核分枝杆菌的基因分型及北京家族进化的初步研究.长沙:中南大学,2012.

[7] Ramazanzadeh R, Sayhemiri K. Prevalence of Beijing family inMycobacteriumtuberculosisin world population: Systematic review and Meta-analysis. Int J Mycobacteriol, 2014,3(1): 41-45．

[8] European Concerted Action on New Generation Genetic Markers and Techniques for the Epidemiology and Control of Tuberculosis.Beijing/W genotypeMycobacteriumtuberculosisand drug resistance. Emerg Infect Dis,2006,12(5):736-743.

[9] Casali N, Nikolayevskyy V, Balabanova Y,et al.Evolution and transmission of drug-resistant tuberculosis in a Russian population.Nat Genet,2014,46(3):279-286.

[10] Buu TN,Huyen MMN,Lan NT,et al.The Beijing genotype is associated with young age and multidrug-resistant tuberculosis in rural Vietnam. Int J Tuberc Lung Dis,2009,13(7):900-906.

[11] Hanekom M,van der Spuy GD,Streicher E,et al.A recently evolved sublineage of theMycobacteriumtuberculosisBeijing strain family is associated with an increased ability to spread and cause disease. J Clin Microbiol,2007,45(5):1483-1490.

[12] Mokrousov I,Ly HM,Otten T,et al.Origin and primary dispersal of theMycobacteriumtuberculosisBeijing genotype: clues from human phylogeography.Genome Res,2005,15(10):1357-1364.

[13] Mokrousov I,Narvskays O,Otten T,et al.Phylogenetic reconstruction withinMycobacteriumtuberculosisBeijing genotype in northwestern Russia.Res Microbiol,2002,153(10):629-637.

[14] Luo T,Yang C,Gagneux S,et al.Combination of Single Nucleotide Polymorphism and Variable-Number Tandem Repeats for Genotyping a Homogenous Population.J Clin Microbiol,2012,50(3):633-639.

[15] Schurch AC,Kremer K,van Soolingen D,et al.Mutations in the regulatory network underlie the recent clonal expansion of a dominant subclone of theMycobacteriumtuberculosisBeijing genotype.Infect Genet Evol,2011,11(3):587-597.

[16] Thierry D, Cave MD, Eisenach KD,et al.IS6110,an IS-like element ofMycobacteriumtuberculosiscomplex.Nucleic Acids Res,1990,18(1):188.

[17] Kurepina NE,Sreevatsan S,Plikaytis BB,et al.Characterization of the phylogenetic distribution and chromosomal insertion sites of five IS6110 elements inMycobacteriumtuberculosis: non-random integration in the dnaA-dnaN region. Tuber Lung Dis, 1998,79(1):31-42.

[18] McHugh TD, Gillespie SH. Nonrandom association of IS6110 andMycobacteriumtuberculosis: implications for molecular epidemiological studies. J Clin Microbiol, 1998,36(5):1410-1413.

[19] van Embden JD, Cave MD, Crawford JT, et al. Strain identification ofMycobacteriumtuberculosisby DNA Fingerprinting:Recommendations for a Standardized Methodlogy. J Clin Microbiol, 1993,31(2):406-409.

[20] Roychowdhury T，Mandal S，Bhattacharya A. Analysis of IS6110 insertion sites provide a glimpse into genome evolution ofMycobacteriumtuberculosis.Sci Rep,2015,5:12567.

[21] Groenen PM, Bunschoten AE, van Soolingen D, et al. Nature of DNA polymorphism in the direct repeat cluster of Mycobacerium tuberculosis: application for strain differentiation by a novel typing method.Mol Microbiol,1993,10(5): 1057-1065.

[22] Kamerbeek J, Schouls L, Kolk A, et al. Simultaneous detection and strain differentiation ofMycobacteriumtuberculosisfor diagnosis and epidemiology. J Clin Microbiol,1997,35(4):907-914.

[23] Hermans PW, Van Soolingen D, Bik EM, et al. Insertion element IS987 fromMycobacteriumtuberculosisbovis BCG is located in a hot-spot integration region for insertion elements inMycobacteriumtuberculosiscomplex strains. Infect Immun,1991,59(8):2695-2705.

[24] Brudey K, Driscoll JR, Rigouts L, et al.Mycobacteriumtuberculosiscomplex genetic diversity: mining the fourth international spoligotyping database (SpolDB4) for classification,population genetics and epidemiology. BMC Microbiol, 2006,6:23.

[25] Flores-Trevio S,Morfín-Otero R,Rodríguez-Noriega E,et al.Genetic Diversity ofMycobacteriumtuberculosisfrom Guadalajara, Mexico and Identification of a Rare Multidrug Resistant Beijing Genotype.PLoS One, 2015,10(2):e0118095.

[26] 王兆芬，李斌，马永成，等.青海省结核分枝杆菌的间隔寡核苷酸分型研究.中华预防医学杂志,2015,49(6):565-567.

[27] Gagneux S,Deriemer K,Nicol M,et al. Variable host-pathogen compatibility inMycobacteriumtuberculosis. Proc Natl Acad Sci U S A, 2006,103(8):2869-2873.

[28] Osman DA, Phelippeau M,Drancourt M,et al.Diversity ofMycobacteriumtuberculosislineages in French Polynesia.J Microbiol Immunol Infect,2015,5(18):1-8.

[29] Gurjav U,Jelfs P,McCallum N,et al.Temporal dynamics ofMycobacteriumtuberculosisgenotypes in New South Wales, Australia.BMC Infect Dis,2014,14:455.

[30] Yen S,Bower JE, Freeman J T,et al.Phylogenetic lineages of tuberculosis isolates in New Zealand and their association with patient demographics.Int J Tuberc Lung Dis,2013,17(7):892-897.

[31] Tessema B,Beer J,Merker M,et al.Molecular epidemiology and transmission dynamics ofMycobacteriumtuberculosisin Northwest Ethiopia: new phylogenetic lineages found in Northwest Ethiopia.BMC Infect Dis,2013,13:131.

[32] Kato-Maeda M,Gagneux S,Flores LL,et al.Strain classification ofMycobacteriumtuberculosis: congruence between large sequence polymorphisms and spoligotypes.Int J Tuberc Lung Dis,2011,15(1):131-133.

[33] Faksri K,Hanchaina R,Sangka A,et al.Development and application of single-tube multiplex real-time PCR for lineage classification ofMycobacteriumtuberculosisbased on large sequence polymorphism in Northeast Thailand.Tuberculosis (Edinb),2015,95(4):404-410.

[34] 高铁杰,李卫民,刘毅,等.北京昌平区北京/W系结核分枝杆菌的流行特征.郑州大学学报(医学版)，2010,45(1):47-50.

[35] Wada T,Iwamoto T. Allelic diversity of variable number of tandem repeats provides phylogenetic clues regarding theMycobacteriumtuberculosisBeijing family.Infect Genet Evol,2009, 9(5):921-926.

[36] Homolka S,Köser C,Archer J,et al. Single nucleotide polymorphisms in Rv2629 are specific forMycobacteriumtuberculosisgenotypes Beijing and Ghana but not associated with rifampin resistance. J Clin Microbiol, 2009,47(1): 223-226.

[37] Alonso M,Navarro Y,Barletta F,et al.A novel method for the rapid and prospective identification of BeijingMycobacteriumtuberculosisstrains by high-resolution melting analysis.Clin Microbiol Infect,2011,17(3): 349-357.

[38] Jiang Y,Liu H,Li M,et al.Single nucleotide polymorphism in Ag85 genes ofMycobacteriumtuberculosiscomplex: analysis of 178 clinical isolates from China and 13 BCG strains.Int J Med Sci,2015,12(2):126-134.

[39] Mestre O,Lou T, Kremer K,et al.Phylogeny ofMycobacteriumtuberculosisBeijing strains constructed from polymorphisms in genes involved in DNA replication, recombination and repair.PLoS One,2011,6(1):e16020．

[40] 罗涛.结核分枝杆菌北京家族菌株的起源、进化及其与现代人类迁移的联系.上海:复旦大学,2012.

[41] Supply P,Mazars E,Lesjean S,et al.Variable human minisa-tellite-like regions in theMycobacteriumtuberculosisgenome. Mol Microbiol, 2000, 36(3):762-771.

[42] Supply P, Lesjean S,Savine E, et al. Automated high throughput genotyping for study of global epidemiology ofMycobacteriumtuberculosisbased on mycobacterial interspersed repetitive units. J Clin Microbiol, 2001, 39(10):3563-3571.

[43] Hanekom M,van der Spuy GD,Gey van Pittius NC, et al.Discordance between mycobacterial interspersed repetitive-unit-variable-number tandem-repeat typing and IS6110 restriction fragment length polymorphism genotyping for analysis ofMycobacteriumtuberculosisBeijing strains in a setting of high incidence of tuberculosis. J Clin Microbiol,2008,46(10): 3338-3345.

[44] Jiao WW, Mokrousov I,Sun GZ, et al. Evaluation of new variable-number tandem-repeat systems for typingMycobacteriumtuberculosiswith Beijing genotype isolates from Beijing,China.J Clin Microbiol,2008, 46(3):1045-1049.

[45] Iwamoto T, Yoshida S,Suzuki K, et al.Hypervariable loci that enhance the discriminatory ability of newly proposed 15-loci and 24-loci variable-number tandem repeat typing method onMycobacteriumtuberculosisstrains predominated by the Beijing family. FEMS Microbiol Lett,2007,270(1): 67-74.

[46] Murase Y,Mitarai S, Sugawara I, et al. Promising loci of variable numbers of tandem repeats for typing Beijing familyMycobacteriumtuberculosis. J Med Microbiol,2008,57(Pt 7): 873-880.

[47] Luo T,Yang C, Pang Y,et al. Development of a hierarchical variable-number tandem repeat typing scheme forMycobacteriumtuberculosisin China. PLoS One, 2014,9 (2):e89726.

[48] 金嘉琳,姜昕,翁心华,等.数目可变串联重复序列分子指纹分型法鉴定北京基因型结核分枝杆菌.中华实验和临床感染病杂志(电子版),2010,4(4):376-382.

[49] Barnes PF,Cave MD.Molecular epidemiology of tuberculosis.N Engl J Med, 2003,349(12):1149-1156.

(本文编辑：范永德)

Progress in identification of Beijing familyMycobacteriumtuberculosis

GUOLi-juan*,HUANGHai-rong,GAOFei,WANGGui-rong.

*InnerMongoliamedicaluniversitygraduateschool,Hohhot010059，China

WANGGui-rong，Email：276761010@qq.com；GAOFei,Email:gaofeiwho@163.com

Tuberculosis is still a big public health problem worldwide. Tuberculosis is mainly caused by Beijing familyMycobacteriumtuberculosisin China. This paper discussed the progress of several genotyping methods including insertion sequence 6110-restricted fragment longevity polymorphism (IS6110-RFLP), spacer oligonucleotide typing (Spoligotyping), large sequence polymorphism (LSP) and single nucleotide poly- morphism (SNP) in identification of Beijing familyMycobacteriumtuberculosis, which will provide a reliable basis for selecting genotyping methods to identify Beijing family strains.

Mycobacteriumtuberculosis; Geneotyper

10.3969/j.issn.1000-6621.2016.02.015

北京市卫生系统高层次卫生技术人才培养项目(2014-3-084)

010059 呼和浩特,内蒙古医科大学研究生学院(郭立娟)；首都医科大学附属北京胸科医院 北京市结核病胸部肿瘤研究所 国家结核病临床实验室 北京市耐药结核病研究重点实验室(黄海荣、王桂荣)；内蒙古自治区第四医院(高飞)

王桂荣，Email：276761010@qq.com； 高飞，Email：gaofeiwho@163.com

2015-09-15)