氢气选择性抗氧化作用在内耳急性损伤防治中的作用

蔡蔚然　周义德第二军医大学长海医院耳鼻咽喉-头颈外科（上海200433）



氢气选择性抗氧化作用在内耳急性损伤防治中的作用

蔡蔚然周义德
第二军医大学长海医院耳鼻咽喉-头颈外科（上海200433）

【摘要】氧化应激产生的活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）过量参与了包括噪声性听力损伤、药物性聋在内的内耳急性损伤过程。近年来研究表明，氢气是一种安全有效的抗氧化剂，可以迅速到达患处与氧化性较强活性氧进行反应，并有效对抗氧化应激。氢气的选择性抗氧化作用可能与降低氧化应激，减轻细胞凋亡，以及调节细胞信号通路相关。研究氢气的抗氧化作用为治疗内耳急性损伤性疾病提供了新思路。本文就氢气在选择性抗氧化作用及其可能的作用机制，以及氢气在内耳急性损伤防治中的研究进展等方面进行综述。

【关键词】噪声性聋；氧化应激；抗氧化；氢气

This work was supported by grants from the National Natural Science Foundation of China（No.81170913），the Scientific Research Foundation for the Returned Overseas Chinese Scholars of State Education Ministry（2010）and the Ministry of Human Resources and Social Security of China（2009）.

Declaration of interest：All the authors report no conflicts of interest.

氢气（H2）是分子量最小、最轻的无色无味的气体，具有一定的还原性。一直以来，氢气由于溶解度较低，被认为难以被人体吸收，是生理上的惰性气体。因此，并未引起研究者们的重视。2007年，Oh⁃sawa I［1］等报道了常温常压下呼吸2%氢气便可有效清除自由基，显著改善脑缺血再灌注引起的细胞损伤。这是首次证明小剂量氢气的治疗作用，引起了探索氢气抗氧化治疗疾病的热潮。氢气的作用机制尚不完全清晰，但有证据表明，氢气的选择性抗氧化作用与降低氧化应激，减轻细胞凋亡，调节信号通路功能息息相关。现诸多研究表明，氢气或氢气饱和生理盐水的运用可以对缺血再灌注损伤、脓毒症、器官移植等疾病及损伤具有保护作用。随着氢气在耳科方面的深入研究，发现其对噪声、药物等因素对内耳造成的急性损伤具有理想治疗效果。

1　氢气治疗疾病的基本作用机制

1.1氢气的选择性抗氧化作用

活性氧是指等多种活性氧化产物的统称，包括自由基（有一个或以上未配对的电子的原子、原子团、分子。如：.O2.、.OH等）及非自由基氧化基团（如H2O2、ONOO-等）。ROS是体内正常氧代谢的产物，是维持正常生理活动如调节血管张力、信号转导等方面所必需的物质。正常情况下，体内存在多种抗氧化酶调节ROS平衡，例如超氧化物歧化酶（SOD）转换超氧阴离子自由基生成H2O2，而H2O2可以通过谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）或过氧化氢酶（CAT）解毒成H2O［2］。但当机体发生氧化应激时，体内ROS急剧增加，超出抗氧化系统平衡能力，细胞内大量积累的ROS（如.O2.，H2O2，.OH）可能扰乱细胞的天然抗氧化防御系统，损坏包括核酸、蛋白质、脂类在内的几乎所有的生物大分子物质。尤其羟基自由基，是最强的氧化剂之一，是生物大分子、细胞的危险杀手。许多疾病，如缺血再灌注损伤、脓毒症和慢性阻塞性肺疾病等的产生及损伤机制，均与ROS过多引起的氧化损伤有关。因此，寻求一种安全有效的还原剂有助于为治疗这些疾病提供新的思路。

研究表明，氢气作为一种弱还原性气体可应用于减轻机体的氧化应激，具有选择性抗氧化作用。所谓选择性抗氧化作用，指的是氢气能够选择性中和羟自由基等具有强氧化性的ROS，同时又不与作为重要细胞信号的ROS反应，安全、有效地逆转组织损伤［3-5］。2007年Ohsawa I［1］等人报道了吸入2%的氢气，便可减少体内羟自由基等强氧化性自由基，起到改善脑缺血再灌注损伤，减少脑梗塞面积的作用。2010年Chihiro Shingu［6］等通过给急性肾缺血再灌注的动物静脉注射富氢生理盐水，发现血浆中的脂质氧化的产物MDA（丙二醛）水平和肠组织DNA氧化的产物8-OHdG（8-羟基脱氧鸟苷）水平明显降低，并提高了血浆SOD和GSH这些抗氧化酶的活性水平。证明了富氢盐水能够通过减少ROS对生物大分子的氧化损伤，并上调抗氧化酶水平，减轻肾脏缺血再灌注引起的氧化应激。诸多研究表明，氢气不仅能直接中和氧化性较强的活性氧，还能上调各类抗氧化酶的水平，增强机体的抗氧化能力。虽然氢气的选择性抗氧化作用机制并不明确，但最新实验研究表明，氢气抗氧化作用可能与机体重要的抗氧化通路Nrf2/ARE-Keap1密切相关。研究者们发现氢气可上调Nrf2/ARE-Keap1通路关键因子Nrf2及其下游抗氧化蛋白（SOD、HO-1等），推测该通路的激活是氢气选择性抗氧化作用的部分作用机制。氢气所具有的这种选择性抗氧化作用是氢气对抗氧化损伤、治疗疾病的理论基础。

1.2氢气的抗凋亡作用

细胞凋亡是细胞自主的程序性死亡，多种途径可导致细胞凋亡的激活。细胞凋亡过程极为复杂，一般认为caspase（半胱氨酸天冬酶）在细胞凋亡中起到了关键作用，阻断caspase可阻止细胞凋亡的进程。在正常细胞中，caspase处于非活化的酶原状态，凋亡程序被激活时，caspase活化，随后发生凋亡蛋白酶的层叠级联反应，发生不可逆的凋亡。此外，氧化应激损伤对细胞凋亡起到了重要的促进作用。细胞内的ROS不仅能直接损伤细胞内的大分子物质，它们也可以通过触发细胞凋亡引起损伤［7］。细胞凋亡在疾病发展中起着关键的作用，是多种疾病形成的共同病理基础。

Cai JM等［8］对脑缺血缺氧的新生鼠进行实验研究，发现持续吸入2%氢气后，海马和皮层脑组织TU⁃NEL染色阳性细胞数减少，caspase-3和caspase-12的活性水平降低，表明氢气对细胞凋亡有抑制作用，对新生鼠脑缺血缺氧损伤产生保护作用。2012年Xie K［9］等研究发现，脂多糖诱导的急性肺损伤小鼠在提前吸入2%氢气后，caspase-3活性降低，TUNEL染色肺细胞凋亡数目显著减少，认为氢气能够明显减轻脂多糖诱导的急性肺损伤引起的细胞凋亡。

1.3氢气的抗炎作用

炎症反应十分常见，是许多疾病共同的病理过程。急性炎症反应过程中白细胞的活化、黏附分子以及细胞因子的表达参与多种疾病损伤。炎症的血管反应和白细胞反应都是通过一系列炎症介质的作用实现的。白细胞介素IL-1 β、IL-6和肿瘤坏死因子TNF-α等细胞因子在介导急性期炎症反应中起到关键作用。高迁移率族蛋白1（HMGB1）作为一种晚期炎症因子，可进一步促进炎细胞的活化和聚集，以及其他炎症介质的生成和释放，从而引起炎症级联反应。

最近研究表明，氢气还具有抑制促炎因子释放，减轻炎症反应的作用。2011年Zhang Y等［11］在大鼠的心肌缺血-再灌注损伤模型中，证实了氢气不仅可以减少心肌梗死的面积，还可以减少中性粒细胞和细胞因子类物质如肿瘤坏死因子（TNF-α）、白细胞介素-lβ（IL-lβ）的浸润。氢气的抗炎作用机制并不明确，目前多项实验研究显示氢气抗炎作用可能与NF-κB信号通路相关。2015年研究表明，腹腔注射氢饱和盐水可以通过影响NF-κB信号通路，降低促炎因子IL-1β、IN-6、TNF-α水平，减轻大鼠蛛网膜下腔出血引起的早期脑损伤［16］。

1.4氢气对信号通路的调节作用

1.4.1氢气与核因子Nrf2通路

核因子相关因子2（Nuclear factor E2 related fac⁃tor 2，Nrf2）是调控抗氧化应激的一种关键转录因子。Nrf2通过与抗氧化反应元件（Anti-oxidative Re⁃sponse Element，ARE）相互作用，启动下游抗氧化酶基因及Ⅱ相解毒酶基因等细胞保护基因的转录，从而在抗氧化应激的适应性反应中发挥重要作用。当受到外界氧化应激因子和亲核物质刺激时，Nrf2转位至细胞核，与ARE启动子部位结合，启动下游编码II相解毒酶或抗氧化酶基因。谷胱甘肽硫转移酶（GSTs）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、NADPH醌氧化还原酶（NQO1）以及血红素氧化酶1（HO-1）等均属于Nrf2下游基因编码。这些抗氧化酶参与调节体内ROS平衡，减轻氧化应激。

2014年Liu等报道［12］，通过盲肠穿孔结扎术建造小鼠脓毒症脑损伤模型后吸入2%氢气，血清及海马组织抗氧化酶（SOD、CAT）活性增加，氧化产物（MDA、8-OHdG）减少，Nrf2及HO-1基因的表达水平上升，脑水肿减轻，说明氢气可以通过上调Nrf2通路水平实现抗氧化作用。Xie［13］等在研究氢气对心肌缺血的影响时，发现氢气使Nrf2及HO-1表达上调，而在利用RNA干扰Nrf2基因沉默后，氢气对心肌细胞HO-1的诱导作用明显变少。这些研究表明，氢气对Nrf2/ARE-Keap1信号通路的上调增强了机体对抗氧化应激的能力，Nrf2/ARE-Keap1信号通路下游抗氧化酶表达增多有利于减少产生的ROS，这些机制可能参与了氢气选择性抗氧化作用。

1.4.2氢气与核因子NF-KB通路

NF-κB是氧化应激的一个细胞内靶点，也可被TNF-α、IL-1β等物质激活。NF-κB转录因子控制了下游成百上千个基因，参与调节细胞生长，细胞分化，炎症反应，细胞凋亡等生物进程［14］。

多项研究表明，氢气具有一定的抗炎作用，可能与NF-κB信号通路相关。2010年Chen H等［10］实验发现，在大鼠急性胰腺炎模型中，通过尾静脉注射饱和氢盐水6 ml/kg，可起到抑制NF-κB的活性，减轻细胞凋亡的作用。2011年Huang等［15］报道在呼吸机致肺损伤小鼠模型中，使呼吸机输送气体中含2%氢气的平衡气体，小鼠吸入2h后，氧张力上升，肺水肿减轻，检测到NF-κB的活性受到抑制，炎症因子水平降低，抗凋亡因子bcl-2的活性上升，实验结果表明，氢气可通过影响NF-κB信号通路起到抑制炎症、氧化应激以及抗细胞凋亡的作用。

2　氢气在其他系统疾病的进展

已有多项研究表明，氢气对中枢神经系统、心血管系统、消化系统等系统器官急性损伤、缺血再灌注损伤等疾病中均有保护作用。

氢气分子量小，可以通过扩散轻易地透过血脑屏障，因此氢气作为保护颅神经的治疗气体有很远大的前景。Ohsawa等［1］发现，吸入氢气通过清除有害的ROS来减小局灶脑缺血再灌注损伤模型大鼠的梗死面积。Shen等［17］在大鼠腹腔注射含饱和氢气的生理盐水（5 mL/kg）10分钟后建立深低温循环骤停模型并进行再灌注，注射氢饱和盐水组较对照组能显著提高血清和脑组织中SOD活性，并对脑缺血再灌注损伤显示出有明显的保护效应。Cai等［9］使脑缺血缺氧的新生鼠持续吸入2%氢气，发现氢气对细胞凋亡有抑制作用，对新生鼠脑缺血缺氧损伤产生保护作用。

在心血管领域，氢气对减轻心肌的缺血再灌注、预防动脉粥样硬化方面都取得了不小的进展。2009年，Sun等［18］首次探索腹腔注射氢饱和盐水对心肌缺血-再灌注损伤的影响，实验结果表明氢气可以通过降低炎症因子TNF-1、IL-lβ水平，减少心肌细胞凋亡，起到保护心功能的作用。2010年，Nakao等［19］对大鼠同种异体心脏移植动物模型的实验研究发现，冷缺血6小时后吸入氢气（＞2%）可减轻心肌缺血-再灌注损伤，冷缺血18小时后联合应用2%的氢气和一氧化碳能够明显降低血清肌钙蛋白I和肌酸磷酸激酶水平，显著减轻心肌缺血-再灌注损伤，减小心肌梗死面积。2014年Huo等［20］发现富氢生理盐水可以通过调节氧化应激，抑制炎症、细胞凋亡而发挥器官保护作用，改善心肺复苏后预后生存。

在消化系统中，氢气亦可通过抗氧化、抗凋亡等作用在急性胰腺炎［10］、阻塞性黄疸等消化系统疾病中起到积极的保护作用。Liu等［21］结扎大鼠胆管，建造阻塞性黄疸肝损伤动物模型，腹腔应用富氢盐水观察效果，实验结果显示血清谷丙转氨酶AST和丙氨酸转氨酶ALT水平显著降低，肝组织MDA含量降低，改善包括肝坏死在内的组织病理学变化。

3　氢气对内耳急性损伤的治疗作用

3.1氢气对内耳急性损伤的临床背景及应用前景

噪声、药物等有害因素对内耳造成的急性损伤均涉及到氧化应激、炎症反应、细胞凋亡等病理过程。然而，由于血-迷路屏障的存在，很多治疗药物并不能有效地到达内耳。最近的动物在体研究表明，通过不同的给药方式（包括吸氢气［38］、腹腔注射富氢生理盐水［29］、喝富氢水［30］），氢气均能有效对抗噪声、药物等对内耳造成的损伤，有效促进听力的恢复。氢气分子量极小，能够迅速到达耳蜗，选择性地中和有害的ROS，发挥其抗氧化作用，因此氢气在治疗内耳疾病方面具有其独特的优点。

3.2噪声性听力损伤

3.2.1噪声对内耳损伤的机制

噪声性听力损伤是感音神经性听力损伤的一种常见类型。尽管目前对噪声引起内耳损伤的具体机制不完全清楚，但目前普遍认为，噪声损伤后ROS在耳蜗内的过度表达是公认的引起耳蜗代谢损伤的重要因素［22］。如果噪声水平达到较高水平或在较低水平持续长时间，便可导致内耳代谢耗竭而引起耳蜗永久性损伤［23］，ROS的产生被认为是此过程的重要组成部分。噪声暴露后，ROS在包括血管、外毛细胞、螺旋神经节、支持细胞等各种耳蜗组织内产生，并且ROS过度表达在噪声暴露后仍然可以持续2周左右［26］。研究发现，噪声暴露后内耳细胞线粒体活性增强，ROS产生过多，堆积于细胞内。过量产生的ROS引起细胞兴奋性中毒和神经元肿胀，并导致Corti器的坏死及细胞凋亡［24，25］。

综上，在治疗及预防噪声暴露引起的内耳损伤及时减少ROS是至关重要的。因此，一系列研究将抗氧化剂（如谷胱甘肽［27］，N-乙酰半胱氨酸［28］等）运用于防治噪声暴露后耳蜗毛细胞损伤和听力下降。然而，这些抗氧剂无法穿过脂质膜屏障，其清除细胞内有害自由基的作用较弱，其有效性和安全性仍然远远不能令人满意。

3.2.2氢气治疗噪声性聋的新进展

氢气作为分子量最小的抗氧化剂，可以通过血-迷路屏障，到达耳蜗。氢气分子甚至可以轻易地扩散进入毛细胞细胞质，线粒体或细胞核，迅速到达目标区域实现高效对抗自由基的影响，可以在细胞中有效中和羟自由基。2010年Zhou［29］对经过噪声暴露24h后的豚鼠进行6天的富氢盐水腹腔注射（2.5 ml/ kg，2次/日）之后进行ABR和DPOAE听功能的检测及Corti氏器琥珀酸脱氢酶染色，从功能和形态学上证明了富氢盐水可以降低噪声对豚鼠的听力损伤，减轻噪声暴露后豚鼠耳蜗毛细胞凋亡和损失。Lin等［30］使豚鼠接受噪声暴露前14天饮用富氢水，与对照组噪声暴露后ABR和DPOAE结果对比发现，氢分子可以促进毛细胞功能恢复，减轻噪声引起的暂时性听力损失，说明了饮用富氢水可对噪声损伤起到一定预防作用。2011年卢燕［31］等发现对豚鼠噪声暴露前进行饱和氢生理盐水腹腔注射，可拮抗强脉冲噪声引起的耳蜗损伤，能够对噪声性聋起到一定程度的预防作用。2014年Chen［32］给豚鼠腹腔注射富氢盐水（10ml/Kg）后进行窄带噪声暴露，发现氢水组豚鼠较对照组显著降低噪声引起的毛细胞损伤和听力损失，并且耳蜗组织内脂质过氧化产物丙二醛、羟基含量显着降低，证明氢饱和生理盐水可以通过抗氧化作用有效预防密集的窄带噪声带来的听力损伤。Takaomi等［33］研究发现噪声暴露后耳蜗底转毛细胞损伤最为严重，而在噪声损伤后急性期吸入1%和1.5%氢气能够降低噪声对听毛细胞的损伤，毛细胞丢失的数目较对照组明显减少。以上研究结果显示，多种氢的给药方式均有效地改善听功能，减轻耳蜗内氧化损伤，减少噪声引起的毛细胞凋亡，但其具体作用机制仍待进一步探索。

3.3药物性听力损伤

3.3.1顺铂引起药物性听力损伤的机制

顺铂作为一种广泛使用的抗癌药物，但其可导致严重且进行性加重的永久性听力损伤。顺铂耳毒性的确切机制仍然不明确，目前认为顺铂通过在细胞内结合DNA，激活炎症级联反应以及氧化应激反应从而引起细胞凋亡，产生内耳损伤［34］。顺铂导致大量ROS在耳蜗内形成，特别超氧阴离子等自由基，导致抗氧化系统紊乱，引起脂质及DNA过氧化反应增加，从而导致毛细胞、血管纹、支持细胞、听觉神经的凋亡［35］，因此顺铂的耳毒性被认为是抗氧化系统损伤的相关疾病。Corti器是顺铂引起的听力损失的主要位点，可导致其中的外毛细胞永久损伤［36］。目前干预顺铂耳毒性的实验研究的目标在于，保护听功能不受损害的同时，也能够达到所预期的抗肿瘤效果［37］。

3.3.2氢气对减轻顺铂及其他药物性听力损伤的新进展

不同耳毒性药物造成内耳损伤的机制不尽相同，但ROS的过量产生在药物性内耳损伤急性期都发挥着重要作用。随着对氢气的深入研究，研究者们发现氢气对某些药物造成的内耳损伤，展现出积极的效果。至于安全性，氢气相对部分抗氧化剂（维生素C等）更加安全可靠，过量的氢可通过呼吸系统排出体外，并且不会减弱顺铂的抗肿瘤作用［38］。Qu等［39］发现吸入2%氢气可以使动物在腹腔注射顺铂后丙二醛及8-OHdG这些氧化产物降低，免疫组化结果表明顺铂诱导Corti器毛细胞的损伤明显减轻。Yayoi［40］等将小鼠使用含不同浓度顺铂的培养基对小鼠耳蜗进行离体培养，观察直接溶于培养基的氢气对耳蜗培养的影响。在离体培养48小时后进行鬼笔环肽染色检测，发现顺铂引起的毛细胞损失具有剂量依赖性，而氢气的加入显著增加总存活听毛细胞的数量。此外，羟苯基荧光素（HPF）的螺旋神经节染色表明，在氢处理的耳蜗中羟基自由基的形成明显减少。这些实验结果表明，氢分子可以减少顺铂对耳蜗听毛细胞的损伤，对于减轻顺铂耳毒性作用具有很好的应用前景。

除顺铂外，Kikkawa等［41］进行体外研究发现氢可能减轻抗毒素A诱导的内耳毛细胞氧化损伤。在耳蜗离体培养中使用含有饱和氢的培养液可以使听觉细胞的ROS产生减少，脂质氧化减少，存活的毛细胞增多。另外，Juan等［42］实验发现，2%氢气可以显著减轻哇巴因引起的螺旋神经节的损伤。

4　安全性及前景展望

氢气是一种自然界常见的无色无味的小分子气体。氢气分子通过自由扩散入血，由于其质量极轻分子量极小的特性，可以迅速扩散至患处，多余氢气亦可以通过呼吸迅速排出体外，不易在体内累积。氢气还原性弱，只与羟自由基等强氧化性ROS反应，且产物为无毒的水。这些特性决定了氢气是相对安全的抗氧化剂。但氢气目前缺乏完善的临床安全性评估，因此应用于临床仍需要大样本临床试验，以确定合适的给药方式、给药剂量并明确其副作用等。

氢气作为一种新兴的安全可靠的抗氧化剂，具有广泛的生物学作用，有着广大的临床应用前景。目前对氢气以选择性抗氧化为基础，对氢气发挥抗炎、抗细胞凋亡等作用的认识基本达成共识，但氢气是否具有作用靶点，作用的信号通路有哪些，如何调节细胞信号通路，这些需要进一步深思与探索。到目前为止，全球关于氢气治疗疾病的基础研究已经得到了广泛的开展，这些研究涉及到多种器官缺血再灌注、急性炎症、创伤、退行性病变等广泛医学领域。氢气的治疗效果不断被报道，作用机制逐渐被认识，研究者们对氢气应用于临床、服务于病患有着较高期望。目前，氢氧雾化机已经获得国家“创新医疗”器械资质，相信随着研究者们不断的深入研究以及不懈努力，氢气不久便可以真正服于临床，为减轻人类病患提供新的思路。

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·综述·

Selective Antioxidant Effect and Protective Role of Hydrogen against Acute Inner Ear Injury

WEI Xinran1，ZHOU Yide1
1 Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery，Changhai Hospital，Second Military Medical University，200433，Shanghai，China Corresponding author：ZHOU YideEmail：ydzhou111@163.com

【Abstract】Excessive Reactive Oxygen Species（ROS）in noise-induced or drug-induced hearing loss causes inner ear serious damage.Recent studies have shown that hydrogen，which acts as a safe and effective antioxidant by reaching the reactive area quickly and reacting with strong oxidizing ROS，can alleviate oxidative stress effectively.Selective antioxidant effect by hydrogen may be related to reducing oxidative stress，decreasing cell apoptosis and regulating cell signaling pathways.Studying antioxidant effects by hydrogen provides a new approach to the treatment of inner ear acute injury.The present review summarizes possible mechanisms of hydrogen in preventing inner ear from acute injury.

【Key words】Noise-induced Hearing Loss；Oxidative Stress；Antioxidant；Hydrogen

【中图分类号】R764.433

【文献标识码】A

【文章编号】1672-2922（2016）03-414-6

DOI：10.3969 / j.issn.1672-2922.2016.03.021

基金项目：国家自然科学基金面上项目（81170913）；国家人力资源和社会保障部留学回国人员科研启动基金（2009年）；国家教育部留学回国人员科研启动基金（2010年）

作者简介：蔡蔚然，医师，硕士研究生，研究方向：耳科学

通讯作者：周义德，Email：ydzhou111@163.com

收稿日期：（2015-10-12审核人：郭维维）