Xpert MTB/RIF 试验用于肺结核快速检测的临床研究

2016-01-24刘旭晖张爱梅卢水华

中华肺部疾病杂志(电子版) 2016年5期

刘旭晖张爱梅卢水华

·论著·

刘旭晖张爱梅卢水华

目的探讨Xpert MTB/RIF 试验用于肺结核病快速检测的诊断价值。方法对上海市公共卫生临床中心呼吸科2014年7月至2015年4月收治的402例肺部疾病患者的呼吸道标本进行Xpert MTB/RIF 试验检测，选取以下四组人群进行分析研究：①高度支持肺结核诊断的人群；②临床排除肺结核诊断的人群；③常规细菌培养以及Xpert MTB/RIF 试验提示利福平耐药的人群；④留取下呼吸道样本(支气管镜检)的人群。所有患者都进行了常规细菌学涂片、培养检测进行对照分析。结果Xpert MTB/RIF试验在本研究中总的敏感性为84.7% (95%CI, 0.81～0.88), 特异性为65.5% (95%CI, 0.51～0.78), 阳性预测值为93.9% (95%CI, 0.91～0.96), 阴性预测值为40.4% (95%CI, 0.30～0.51)。 Xpert MTB/RIF试验比常规的细菌涂片+培养的方法敏感性更好 (84.7%vs. 58.8%,P<0.001). Xpert MTB/RIF试验发现了11.8%的利福平耐药，与常规的细菌学培养结果无显著差异。本研究中Xpert MTB/RIF试验对114例下呼吸道灌洗标本的检出率为79.8%(91例)，略高于上呼吸道标本(70.2%，P=0.126)。结论Xpert MTB/RIF 试验用于快速检测肺结核病，其敏感性优于传统的细菌学检测方法，并且能准确预测利福平耐药的出现，是一种值得推荐的新检测手段。Xpert MTB/RIF 试验对下呼吸道标本中结核菌的检出率略高于上呼吸道标本，两者未见明显统计学差异。

Xpert MTB/RIF 试验；聚合酶链式反应；肺结核；耐药性

对于发展中国家来说，结核病的负担依旧沉重。抗结核药物的耐药率逐年上升，但是菌株耐药性的检测效率依然低下，结核病的快速诊断及耐药性检测是公共卫生领域的世界性难题[1-4]。对于结核菌及其耐药性的传统检测方法是抗酸染色镜检和结核分枝杆菌培养。在实际临床应用中，抗酸染色的阳性率低，敏感性差，结核杆菌培养周期长且阳性率低，不能满足快速诊断的需要。Xpert MTB/RIF试验以全自动半巢式实时PCR技术为基础，以rpoB基因为靶基因，可在2h内同时检测结核分枝杆菌和利福平耐药，对于结核病的快速诊断有重要意义。本研究将不同临床背景的人群进行分组比较，旨在对Xpert MTB RIF试验的临床诊断价值进行评估。

对象和方法

一、研究对象

对上海市公共卫生临床中心呼吸科从2014年7月至2015年4月收治的肺部疾病患者进行筛选，纳入标准如下：①未进行抗结核治疗，能够留取足够的呼吸道标本，有细菌学检测结果; ②所有患者临床资料、影像资料完整，最终诊断由临床医生、影像科医生共同完成;③所有患者完成2个月随访对出院诊断进行评估; ④排除HIV感染者。结核病诊断标准按照中华医学会结核病学分会2013年发布的《肺结核诊断和治疗指南》制定。

二、样本收集及检测流程

留取患者清晨深部痰液标本检测，8 h内进行Xpert MTB/RIF试验检测及常规细菌涂片培养。下呼吸道灌洗液标本处理方法同痰液。

1. Xpert MTB/RIF试验[5-7]：用匀浆器将痰液在生物安全柜条件下充分匀浆后，按1︰2比例加入标配处理液，震荡混匀(若混匀液粘稠，可适当加大比例至呈均匀、无悬浮物液体)，室温静置15 min，取2 ml混合液转移至一次性多室塑料反应盒中。样品自动洗涤和过滤，自动超声破碎样品，释放核酸，DNA与PCR试剂混合，半巢式荧光定量PCR扩增和检测，打印结果。

2. 常规细菌学检测：痰标本进行抗酸涂片荧光显微镜检测以及BACTEC MGIT 960液体培养系统培养。

三、分组方法

根据研究对象的临床资料及随访结果取以下四类人群的检测结果进行分析：①高度支持肺结核诊断的人群，包括菌阳肺结核和菌阴肺结核；②临床排除肺结核诊断的人群，包括确诊其他肺部疾病并治疗有效者，以及不符合结核诊断标准并在随访过程中未发现任何结核病依据者；③常规细菌培养以及Xpert MTB/RIF 试验提示利福平耐药的人群；④取下呼吸道样本的人群，指通过纤维支气管镜留取支气管灌洗液标本的人群。

四、统计学方法

采用GraphPad Prism 5.0统计软件进行检测分析，以中华医学会结核病学分会2013制定的结核病临床诊断标准为本研究的主要诊断标准，计算敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值及其95%置信区间。

结果

本研究共纳入402例患者，年龄15～84岁(中位年龄49岁)，男性257例，女性145例，其中114例支气管灌洗液标本获得检测结果。125例(31.1%)患者痰抗酸杆菌涂片(3次)阳性；222例(55.2%)符合菌阴肺结核的诊断标准，189例(47.0%)患者细菌培养为结核分枝杆菌复合群；55例(13.7%)患者排除结核病诊断。Xpert MTB/RIF试验共检测出了313例阳性标本，其中真阳性294例，假阳性19例，敏感性为84.7%(95%CI, 0.81～0.88)，特异性65.5%(95%CI, 0.51～0.78)，阳性预测值为93.9%(95%CI, 0.91～0.96)，阴性预测值40.4%(95%CI, 0.30～0.51)。Xpert MTB/RIF试验检出率显著高于常规培养方法[84.7%(294/347)vs. 54.5%(189/347)，P<0.001]，同时显著高于痰抗酸杆菌涂片+细菌培养的联合检出率[84.7%(294/347)vs. 58.8%(204/347)，P<0.001]。MTB/RIF试验在痰抗酸涂片阳性患者中的检出率高于在抗酸涂片阴性患者中的检出率[91.2%(114/125)vs. 81.1%(180/222)，P=0.013]。

Xpert MTB/RIF试验检测出利福平耐药率11.8%(41/347)，同时进行的细菌培养检出利福平耐药率10.7%(37/347)，两种检测方法均检出利福平耐药者30例，MTB/RIF试验检出而细菌培养未检出耐药11例，细菌培养检出而MTB/RIF试验未检出耐药7例，两种方法的检出率无明显统计学差异(P>0.05)。30例吻合的结果中，同时合并异烟肼耐药的菌株共有11株(36.7%)。

Xpert MTB/RIF试验对114例下呼吸道灌洗标本中结核菌的检出率为79.8%(91例)，略高于上呼吸道标本(70.2%，P=0.126)。

讨论

一、Xpert MTB/RIF试验的原理及优越性

Xpert MTB/RIF试验以Gene Xpert系统平台及以半巢式实时定量PCR技术为基础，将rpoB基因做为靶基因，自动提取DNA后扩增rpoB基因的192 bp片段进行检测，采用6种分子信标同时检测6种探针，其中5个相互重叠的分子探针(分别以探针A-E命名)选择性覆盖rpoB基因的8l bp核心区，检测结核分枝杆菌存在的同时可以探知利福平是否耐药。Gene Xpert系统是一种封闭性及自动化程度极高的检测平台，将标本放入一次性反应容器后不需要再次接触检测标本，系统可自动完成标本纯化、离心、DNA提取、DNA扩增、DNA特异序列检测、结果自动读出等多个程序，2 h内可以完成检测。这些特点都显示出了超过传统检测方法的优越性，因此有潜在的推广价值，目前世界卫生组织已向全世界推广这种检测手段[8]。

二、Xpert MTB/RIF试验诊断活动性肺结核病的价值

Xpert MTB/RIF试验的敏感性优于传统的细菌涂片及细菌培养检测，而且检测速度快，有利于结核病的早期诊断。尤其值得一提的是Xpert MTB/RIF试验在痰结核菌抗酸染色阴性的患者中具有高达81.1%的阳性率，显著提高了此类患者的诊断效率，减少了结核病的漏诊率。本研究获得的特异度、阴性预测值均不理想，分别为65.5%和40.4%。这个结果可能源于非结核病组人群中Xpert MTB/RIF试验的阳性例数偏高(19/55)。这19例患者包括11例肺部感染，2例胸腔积液,2例肺部肿瘤， 4例非特异性炎症。肺部感染及胸腔积液病例均在未使用抗结核药物的情况下治疗好转并随访2月未复发，肺部肿瘤及肺部非特异性炎症均有肺穿刺诊断。目前发表的多项研究中均提示Xpert MTB/RIF试验的假阳性率极低[9-17]，因此在本研究中发现的“假阳性”病例有更可能是真的存在结核感染而目前的临床诊断标准尚不能确诊的病例。对于这一点，可能与国内高结核感染的背景有关，这些阳性结果可能需要更长时间的随访才能最终确定。

三、非结核分枝杆菌对于Xpert MTB/RIF试验的影响

目前我国常见的非结核分枝杆菌(nontuberculosis mycobacteria, NTM)包括堪萨斯分枝杆菌、鸟-胞内分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、海分枝杆菌等，这些细菌广泛存在自然界，并可能定植于肺部疾病患者的呼吸道中。部分非结核分枝杆菌中也存在rpoB基因或类似基因，理论上有可能造成假阳性结果。目前在已发表的多项关于Xpert MTB/RIF试验检测报道中，非结核分枝杆菌造成假阳性的比例仅为0.6%[9]，因此本研究中未将其作为结果影响因素进行分析。

四、利福平耐药性检测

利福平作为最重要的抗结核药物之一，其作用原理是抑制菌体上rpoB基因编码的RNA聚合酶。几乎所有利福平敏感菌株在该区域均具有相同的核酸序列，而95%以上的利福平耐药菌株都有rpoB基因变异。rpoB基因变异引起利福平耐药后，异烟肼出现耐药的风险也明显升高[18]。当细菌对两种最主要的抗结核药物都出现耐药时，肺结核的治疗难度会极大增加。传统的利福平耐药检测依赖于细菌培养，平均耗时超过15 d以上(本研究中的平均药敏检出时间为33 d)，而Xpert MTB/RIF试验可在2 h内提供检测结果，对于耐药的早发现有积极意义。本研究中，两种方法检测利福平耐药的敏感性无明显差异，有4例耐药结果不吻合。此类不吻合结果可能归昝于表型耐药检测(细菌培养)和基因耐药检测(Xpert MTB/RIF试验)的差异性。表型检测耐药而基因检测敏感的可能原因包括：①存在非rpoB编码的耐药位点、菌株细胞膜通透性改变、存在膜外排泵等；②表型敏感而基因检测耐药的可能由于基因的无明显突变。

五、呼吸道标本的选择

本研究中下呼吸道灌洗液的结核菌阳性检出率略高于上呼吸道标本，两者未见明显统计学差异。由于本研究中选取的样本量有限，而且进行支气管灌洗的患者多有明显支气管病变，不能完全代表一般肺部疾病患者的情况，本研究不能充分判断灌洗液是否有更好的检测价值，需要更多相关研究证实。同时应认识到肺结核病是临床上常见的呼吸系统传染性疾病，如何提高肺结核的诊断率，防止误诊、漏诊是临床上不可忽视一个重要问题，特别注意加强肺结核的防治工作[19-20]。

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(本文编辑：王亚南)

刘旭晖，张爱梅，卢水华. Xpert MTB/RIF 试验用于肺结核快速检测的临床研究[J/CD]. 中华肺部疾病杂志：电子版， 2016， 9(5)： 524-527.

LiuXuhui,Email:liuuhui@shaphc.org

Objective To evaluate the clinical performance of Xpert MTB/RIF Assay for the diagnosis of pulmonary tuberculosis. Methods During July, 2014 to April, 2012, 402 cases with pulmonary diseases were involved in this study and respiratory tract specimens were carefully tested. Four groups were identified to analyze: (1) patients with clinical diagnosis of pulmonary tuberculosis; (2) patients clinically excluded from pulmonary tuberculosis; (3) patients with rifampin resistance; (4) patients with bronchial larvae specimen tested. All cases were not treated with anti-tuberculosis drugs before specimen collection and paired specimens were acid fast stained and cultured by Bactec MGIT 960 system. Result The overall sensitivity of Xpert MTB/RIF Assay in this study is 84.7% (95%CI, 0.81 to 0.88), specificity is 65.5% (95%CI, 0.51 to 0.78), positive predict value is 93.9% (95%CI, 0.91 to 0.96), negative predict value is 40.4% (95%CI, 0.30 to 0.51). Xpert MTB/RIF Assay is more sensitivity than traditional culture and acid fast stain method (84.7%vs. 58.8%,P<0.001). Rifampin resistance identified by Xpert MTB/RIF Assay is 11.8%, which shows no significant difference with culture method (10.7%,P=0.72). Lower respiratory tract specimens have relatively higher MTB/RIF Assay positive rate than upper respiratory tract specimens, but no significant difference (P=0.126). Conclusion Xpert MTB/RIF test for rapid detection of tuberculosis bacteriology detection method of the sensitivity is better than the traditional, and can accurately predict the emergence of Rifampicin resistance, it can be recommended as a new means of detection. Xpert MTB/RIF test of Mycobacterium tuberculosis in lower respiratory tract specimens detection rate is slightly higher than that of the upper respiratory tract specimens, while there is no significant difference.

Xpert MTB/RIF Assay; PCR; Tuberculosis; Drug resistance

10.3877/cma.j.issn.1674-6902.2016.05.012

201508 上海市公共卫生临床中心呼吸科

刘旭辉，Email: liuuhui@shaphc.org

R563

2015-08-10)

Clinical evaluation of using Xpert MTB/RIF assay as a rapid diagnosis of tuberculosisLiuXuhui,ZhangAimei,LuShuihua.Respiratorydepartment,ShanghaiPublicHealthClinicalCenterAffiliatedtoFudanUniversity,Shanghai201508,China