结核分枝杆菌对吡嗪酰胺耐药的检测方法研究与进展

胡严杰 黄海荣



·综述·

结核分枝杆菌对吡嗪酰胺耐药的检测方法研究与进展

胡严杰 黄海荣

吡嗪酰胺(pyrazinamide, PZA)是重要的一线抗结核药物之一，对细胞内的结核分枝杆菌具有独特的杀菌作用，因此成为结核病短程化疗的基石。同时，鉴于目前治疗耐多药结核病新药的缺乏，WHO建议全程使用PZA治疗耐多药结核病。结核分枝杆菌对PZA耐药的相关基因pncA及其启动子区的突变位置分散且类型繁多，使一般的分子学诊断方法不易进行操作与检测。作者对现有的PZA耐药性检测方法的原理及新检测方法的研究进行综述与展望。

吡嗪酰胺； 分枝杆菌, 结核； 微生物敏感性试验； 表型； 基因型； 实验室技术和方法； 综述

2015年全球新增结核病患者约960万例，其中3.3%的初治患者和20%的复治患者为耐多药结核病患者[1]。吡嗪酰胺(pyrazinamide, PZA)可杀死处于半休眠期的结核分枝杆菌，从而将治疗周期从9～12个月缩短至6个月，因而成为结核病短程化疗的基石[2-3]。近年来有研究表明，使用PZA治疗的原发耐多药结核病患者的预后优于未使用的患者[4]，因此，世界卫生组织(WHO)建议使用PZA应贯穿耐多药结核病患者的整个疗程。然而，由于对PZA的药物敏感性试验(简称“药敏试验”)需要特殊的酸性环境，使得其不易操作且结果可重复性差，因此对PZA的药物敏感性检测并未常规纳入日常的药敏试验[5]。由于临床对PZA药敏试验的需求，可靠的方法一直处于寻求、探索过程中，笔者将分别对PZA耐药的表型检测方法和分子检测方法的检测原理、特点进行综述。

表型药敏试验方法

PZA是一种烟酰胺类似物，被转运到巨噬细胞内后在吡嗪酰胺酶(pyrazinamidase, PZase)的作用下生成吡嗪酸(pyrazinoic acid, POA)进而发挥抗结核作用[1]。POA在中性条件下以POA-的形式存在，一部分POA-通过外排作用转运到细胞外，在酸性环境下，POA-被还原成不带电荷的POA分子。由于POA的动态平衡，不带电荷的分子再次被转运到结核分枝杆菌胞内，进入时带入一个质子，经过大量累积后结核分枝杆菌的细胞质酸化，从而导致细菌死亡[6-8]。表型药敏试验方法是将结核分枝杆菌与药物共同孵育一段时间后，通过直接或间接观察细菌的存活状态，判断细菌是否耐受PZA。

一、根据菌量检测的方法

1.BACTEC MGIT 960液体培养基法：是WHO推荐的一种液体培养检测MTB对PZA是否敏感的方法，是目前应用最为广泛的PZA耐药性检测方法[9]。其原理是应用BACTEC MGIT 960分枝杆菌培养系统比较一定周期内含药培养管和对照管是否因耗氧量不同而激发产生不同强度的荧光，从而推测含药培养管中的菌量占对照培养管菌量的比例，并由此判断细菌是否耐受PZA。此方法中PZA的终浓度为100 μg/ml，液体培养基的pH值设定为6.0[10]，21 d后可得到检测结果，是目前认可度较高的PZA药敏试验方法。欧洲的一项研究以BACTEC 460为参照标准，应用MGIT 960系统进行的PZA药敏试验结果与其一致率达到98.3%[10]。

2.VersaTREK-ESP System Ⅱ的PZA药敏试验法：其原理是将VersaTREK全自动微生物探测系统(VTI)及ESP®培养系统Ⅱ(ESP)配合使用，通过连续监测(24 min/次，若无阳性信号出现，最多检测12 d)培养瓶顶空中氧气的消耗率检测分枝杆菌的生长，并通过阳性信号报告生长响应。在生长对照瓶检测报阳后3 d内含药生长瓶也报阳则为耐药，反之则为敏感。此方法同样需要酸性环境，PZA终浓度为300 μg/ml，但仅需14 d即可得到结果。该方法检测结果文献报道显示，以BACTEC 460为金标准，该方法的敏感度为88.0%，特异度为92.3%[11]。Espasa等[11]的一项以BACTEC MGIT 960为对照的研究中，显示其敏感度和特异度分别为97.0%和100.0%。

以上两种方法均需要昂贵的设备和试剂，影响了其在临床上的全面推广，而且越来越多的报道认为此类药敏试验的可重复性不够理想，原因可能有以下几种因素：(1)酸性环境不利于结核分枝杆菌的生长[12]；(2)接种量依靠比浊法稀释细菌确定，肉眼观察误差较大，易出现假阳性[13]；(3)PZA对不同生长状态的结核分枝杆菌的杀伤力不相同[14]。

二、PZase活性检测法

1.韦恩法(Wayne法)：在PZase催化下PZA转化为具有还原性的POA，而转运到细菌膜外的POA分子可与硫酸亚铁氨发生反应生成红色的硫酸亚铁。将结核分枝杆菌接种到含有PZA的固体培养基上，4 d后向培养基上滴加硫酸亚铁铵，通过观察培养基颜色变化可以推测是否有POA生成，从而判断PZase是否具有活性。PZase有活性表明细菌对PZA敏感，否则判定为耐药。Cui等[10]的一项研究表明，以MGIT 960系统进行的PZA药敏试验作为对照，Wayne法的敏感度为88.2%，特异度为98.5%。该方法操作简单，特异度较高且检测周期短，但其敏感度较低，操作需要菌量较大，可重复性较差，因此没有得到广泛认可[15-16]。

2.底物类似物显色法：烟酰胺是PZA类似物，其也能在PZase的作用下转化成活性状态，且该转化无需酸性环境，因此有学者尝试用烟酰胺替代PZA作为底物检测结核分枝杆菌的PZase活性[17]。本方法的基本原理与Wayne法相似，但结果判定采用结核分枝杆菌液体药敏试验常用的比色法。常见的比色法包括：刃天青微量滴定分析法(resazurinmicrotiter assay, REMA)、硝酸盐还原法(nitrate reductase assay, NRA)和噻唑蓝比色法(MTT法)。Cui等[10]的一项研究结果显示，以MGIT 960法为标准，MTT法的敏感度为97.0%，特异度为99.6%。而泰国的一项研究结果显示，以MGIT 960法作为对照，MTT的敏感度仅为88.0%，特异度为78.0%[18]。比色法操作简便，不需要特殊仪器，结果易于判定，成本低，且能在10～14 d得到药敏试验结果。该方法利用烟酰胺替代PZA，解决了检测pH值和结核分枝杆菌生长所需pH值矛盾的问题；但该方法缺乏标准化，因此尚无法推广[10,17]。

耐药基因突变检测技术

PZase是由MTB的pncA基因编码的蛋白，研究表明pncA基因及其启动子区序列的突变是造成PZase活性降低或缺失的主要原因[19]，也是对PZA产生耐药的主要原因。

pncA基因全长561 bp，基因及其启动子序列的突变形式包括点突变、插入和缺失，可能发生突变的碱基几乎覆盖了整个基因，因此不便于应用常用的基于探针杂交的分子检测技术，诸如分子信标法、TaqMan探针法等。同时，有报道认为pncA基因突变不一定造成PZA耐药，如Ramirez-Busby等[20]的Meta分析发现83%的pncA基因突变会造成对PZA耐药，而17%的pncA基因突变不会造成耐药。这一因素大大削弱了通过检测pncA基因及其启动子区的序列差异来诊断结核分枝杆菌对PZA耐药的价值。不过，鉴于作为对照方法的结核分枝杆菌PZA耐药表型药敏试验方法存在不可靠的问题，分子检测技术的真实价值仍有待更多的评估，而鉴于其耗时短的优势，因此这一领域仍然激发了很多研究兴趣。

1. DNA序列测定技术：DNA测序技术是一种分析特定DNA序列碱基排列的技术，可以对DNA的突变进行定位和鉴定研究。2011年的一篇综述分析显示，以MGIT 960法作为对照，DNA测序技术诊断结核分枝杆菌对PZA耐药的敏感度和特异度分别为90.0%和 94.0%；以BACTEC 460法为标准时，DNA测序技术的敏感度和特异度分别为87.0%和95.0%；以MGIT 960法作为对照时，DNA测序技术的敏感度和特异度分别为85.0%和88.0%[21]。DNA测序技术是突变检测的“金标准”，随着该技术自动化程度的提高及成本的降低，DNA测序技术将成为未来基因检测的常规手段。

2. Surveyor酶酶切法：Surveyor酶是植物中提取的核酸内切酶，它与普通内切酶不同之处在于其可特异性切割DNA错配部位，这种切割对核苷酸序列无特殊要求，不需要知晓pncA突变的具体位置和类型[22]。该方法先将野生型pncA基因的PCR产物和待测样品的pncA基因的PCR产物混合，在变性和复性过程中，形成同源或异源双链，在Surveyor 酶作用后电泳，如果待测样品没有突变、插入和缺失位点，则Surveyor酶不能发挥作用，电泳图谱上仅有单个条带；如果待测样品含有突变、插入和缺失位点，则形成一条异源双链和一条同源双链，此时Surveyor酶发挥作用，将异源双链切断，此时电泳图谱上有3条或者更多条带[22]。有一项研究采用该方法分析了10株临床分离株对PZA的耐药性，仅有1株与PZase活性检测结果不一致[23]。采用Surveyor酶酶切法操作简单，无需特殊仪器，具有推广价值。该技术已经应用在其他疾病的基因突变检测，但在结核病检测方面应用较少。

3. 高分辨率熔解曲线(high resolution melt，HRM)：HRM是新近发展起来的建立在实时荧光定量PCR基础上的突变检测技术。HRM将野生型样品和待测样品加到同一样本管中进行PCR后杂交形成同源或异源双链，利用饱和荧光染料能与双链DNA进行特异性结合，利用同源双链和异源双链的熔解温度不同、荧光染料脱落的温度也不相同来区分野生型和突变型。该方法通过设计交叉引物覆盖pncA及其启动子序列，通过多管检测即可分析出pncA及其启动子序列的基因型，不需要知道突变的碱基位点和突变类型。有研究者用HRM技术分析了127株临床分离株，并与BACTEC MGIT 960药敏试验结果对比，其敏感度为85.5%，特异度为98.5%[24]。HRM法是闭管检测，从而避免了污染造成的假阳性。目前，HRM技术已经在结核病耐药分子诊断领域得到应用，未来此项技术也有希望用于结核分枝杆菌对PZA耐药的分子检测。

4. 微阵列技术：微阵列片技术采用原位合成或微量点样等方法，将已知序列的DNA片段固定在支持物表面，然后采用含有特异性标记的样品分子进行杂交，通过检测特异性信号强度来获取样品的序列信息。有研究者设计了79种特异性探针序列检测结核分枝杆菌对PZA耐药的pncA基因，其结果与测序一致[25]。这说明该方法具有很高的敏感度和特异度，可快速识别设定的突变位点，但微阵列技术需要大量探针，且杂交过程操作复杂，因此易于发生污染。未来自动化技术的发展可能有助于解决这些问题，但是此技术需要昂贵的仪器设备，极大地限制了该技术的临床应用。

问题和展望

虽然临床目前对PZA进行药敏试验的检测技术很多，但现有技术都存在不同程度的缺陷。对PZA进行表型药敏试验的难点在于液体培养技术需要pH=5.5～6.0的条件，而结核分枝杆菌的生长需要中性环境，从而可能导致假阳性结果的出现；比色法和产物显色法均不能区分PZase的活性高低，容易导致假阴性结果出现；基因突变检测技术需要首先建立结核分枝杆菌对PZA耐药与基因突变间良好的一致性关系。目前，PZA的杀菌机制还未完全阐明，相信随着对其杀菌机制和耐药机制研究的不断深入，同时随着分子生物学技术的不断发展，未来一定能够建立可靠而实用的PZA药敏试验的检测方法。

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(本文编辑：王然 李敬文)

Progress of pyrazinamide-resistanceMycobacteriumtuberculosisdetection

HUYan-jie,HUANGHai-rong.

NationalTuberculosisClinicalLaboratory,BeijingTuberculosisandThoracicTumorResearchInstitute,Beijing101149,China

HUANGhai-rong,Email:huanghairong@tb123.org

Pyrazinamide (PZA) is one of the most potent anti-tuberculosis (TB) drugs which has unique bactericidal activity within cells, therefore, it is the core of short-course chemotherapy for TB. Recently, WHO suggested using PZA through out the treatment course of multiple drug-resistant TB because of lack of new drugs. As location of the mutation in the promoter is scattered and the types are various,pncAgene, which is related with PZA-resistant, is difficult to be detected using the general molecular test. In this article, the advancement of PZA-resistance TB detection will be reviewed.

Pyrazinamide;Mycobacteriumtuberculosis; Microbial sensitivity tests; Phenotype; Genotyp; Laboratory techniques and procedures; Review

10.3969/j.issn.1000-6621.2016.09.014

101149 北京市结核病胸部肿瘤研究所 国家结核病临床实验室

黄海荣，Email：huanghairong@tb123.org

2016-07-05)