大力加强非结核分枝杆菌病的实验室诊断研究

郑惠文 赵雁林



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大力加强非结核分枝杆菌病的实验室诊断研究

郑惠文 赵雁林

非结核分枝杆菌(NTM)病的发病率在全球逐年增加，但由于NTM病与结核病相比有相似的临床症状，且致病菌种繁多，鉴别诊断困难，增加了治疗的难度，所以对分枝杆菌进行菌种鉴定将在疾病的诊断、治疗及预后上具有重要意义。现代细菌学方法的快速鉴别诊断，以及随着免疫技术和分子生物技术的发展，为NTM的鉴定提供了更快速、准确的诊断方法。

分枝杆菌, 非典型性； 实验室技术和方法； 诊断, 鉴别

非结核分枝杆菌(non-tuberculous mycobacteria, NTM)是一种条件致病菌，包括200多种不同的分枝杆菌[1]。自1899年Lenmann与Neumann在环境中分离到不同于结核分枝杆菌的分枝杆菌，并将其命名为草分枝杆菌后，NTM菌种陆续被发现。虽然NTM对人的致病程度较结核分枝杆菌弱，但最近几年发现许多NTM菌种与人类感染有关，如肺病、皮肤和可播散性疾病。对患有囊性纤维性变(cystic fibrosis, CF)、支气管扩张和免疫抑制状态的患者有很大的威胁[2]。由于NTM病不会传染，大多数国家并不强制报告，因此监测数据不仅有限且不可靠[3]。现有资料表明，在世界范围内NTM病的患病率不断增加，在许多国家已有报道，包括加拿大[4-5]、美国[6-7]、英国[8]、德国[9]、日本[10]。我国NTM的分离率也出现逐年增加的趋势[11]，山东省多个地区的阳性培养标本中，1.37%为NTM[12]，江苏NTM占3.37%, 上海NTM占5.9%，福建NTM占10.2%，广东NTM占19.2%[12-16]。饮水系统中NTM的增加，老年人、慢性阻塞性肺疾病、过敏性肺炎、肾透析或脏器移植时给予免疫抑制药、恶性肿瘤患者，以及肾上腺糖皮质激素的应用等都可使NTM病发病率增加[17-20]。但由于NTM病与结核病相比有相似的临床症状，且致病菌种繁多，鉴别诊断困难，增加了治疗的难度。所以，对分枝杆菌进行菌种鉴定将在疾病的诊断、治疗及预后上具有重要意义[21]。

近年来, NTM的临床实验室分离频率有所增加, 这与现代细菌学方法的快速鉴别诊断密切相关, 并且随着免疫技术和分子生物技术的发展，为NTM的鉴定提供了更快速、准确的诊断方法。笔者就目前NTM感染常用实验室诊断方法总结如下。

一、抗酸染色和细菌培养

涂片镜检是一种快速检测分枝杆菌的廉价方法，目前常用的方法包括萋-尼抗酸染色和金胺O荧光染色。但不能将NTM与结核分枝杆菌区分，特异度较差[1]。核酸扩增(NAA)实验是直接从临床样本中快速检测分枝杆菌的理想方法，敏感度高于涂片镜检[22]。许多商业化的测试已被广泛使用，如Xpert MTB/RIF和CobasTaqMan MTB。赵冰等[23]通过评价Xpert MTB/RIF检测技术在结核病诊断中的应用证实，其敏感度高于涂片镜检和固体培养试验。

痰标本培养仍然是实验室鉴定NTM的金标准，常用的培养基包括固体培养基和液体培养基。固体培养基包括以鸡卵为固化及营养成分的培养基(如罗氏培养基)，或以琼脂为基础的培养基(如7H10和7H11)。在固体培养基上可观察分枝杆菌的克隆形态、生长速度，并能依据产色来鉴别菌种，对感染的微生物进行定量。目前，实验室常用的液体培养基是荧光底物培养基、C标记底物的培养基(BAETEC 460系统)、荧光感应器检测系统(BACTEC 960和MGIT系统)。液体培养的敏感度高于固体培养基，并且培养时间短，但易于被其他微生物污染。因此，所有的分枝杆菌都应进行固体和液体培养，两种方法的同时使用能够将检测NTM的敏感度增加15%[24]。

二、免疫学鉴定

免疫胶体金技术(immune colloidal gold technique)，是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种新型的免疫标记技术。MPB64抗原胶体金法利用MPB64蛋白(结核分枝杆菌在生长繁殖中分泌的一种具有特殊作用的蛋白质)在NTM中极少存在的特点设计的，由此可以进行初步菌种鉴定[25]。分枝杆菌培养物悬浊液或培养液均可直接作为标本，加入胶体金检测孔中15 min后即可观察结果。当检测区未出现紫红色条带时为阴性结果，表明培养物中无MPB64蛋白，即可判定此分枝杆菌菌种为NTM。张帆等[26]用MPB64抗原胶体金法进行NTM鉴定，敏感度为96.9%，特异度为100.0%，与传统分枝杆菌菌种鉴定方法检测的一致率为97.8%。此方法操作简便，不需要特殊的仪器，能在短时间获得结果，但该法仅能用于NTM的初步鉴定，无法对NTM菌种进行进一步鉴定。

三、分子学鉴定

由于NTM分离株的临床特点和药物敏感性特征有很大的不同，临床治疗方案也不同，这使得NTM菌种鉴定非常重要。因此，建议将NTM菌种鉴定到种[24]。在过去20年间，实验室鉴定分枝杆菌的方法发生了明显的变化，分子学方法已经代替了传统的生化方法和高效液相色谱技术，如线性探针杂交，限制性片段长度多态性聚合酶链反应，实时荧光定量PCR，以及DNA测序[22, 24]。

分子线性探针(line probe assay, LPA)将分枝杆菌特异的基因序列用探针标记，来识别与之互补的特异基因序列，通过酶联免疫显色，从而将NTM与结核分枝杆菌区分开来，以德国HAIN Lifescience公司的Genotype MTBDR(the Genotype MTBDR LPA, MTBDR-LPA) 分子线性探针法为代表。陈琛和马远征[27]研究发现MTBDR-LPA与BACTEC MGIT 960的抑制率高达100.0%, 与基因测序法结果一致率为91.3%。该方法具有操作简便、快速、准确的特点，但成本较高，鉴定的种类有限，直接应用到临床检测中仍很困难。

荧光定量PCR 通过将双重PCR和Taqman 探针技术相结合，针对分枝杆菌的特异性序列设计探针和引物，探针用不同的荧光基团进行标记，从而对分枝杆菌的核酸进行定性检测。当反应体系中有目的基因存在时，随着反应的进行，不断释放出荧光，通过检测荧光信号强度的变化实现菌种的鉴别。张洁等[28]通过比较PCR-荧光探针与传统培养法对菌种的鉴定，发现PCR-荧光探针法鉴定结核分枝杆菌复合群和NTM的准确性较高，与测序相比复合率达到100.0%。该方法能够缩短检测报告周期，且检测结果准确，可以满足临床确诊的需求。

基因测序是NTM菌种鉴定的金标准，并且可用于不常见的菌种或将菌种鉴定到亚种水平。其中，16S rRNA基因测序快速、准确，被认为是鉴定分枝杆菌的金标准[29]。16S rRNA含有1500个核苷酸序列，具有高度保守性和相对可变性，对保守区进行扩增测序能将细菌鉴别到种、属。可变区是分枝杆菌属或种所特有的，对其进行分析可将生物菌种鉴定到亚种水平。然而，16S rRNA基因对新的菌种或亲缘关系近的菌种无法区分。因此，需要选择多态性更高的靶基因，如RNA聚合酶的β亚基 (rpoB)、热休克蛋白65 (hsp65)、16S-23S rRNA基因间隔区 (ITS) 等基因[30]。更多同源序列的联合应用能够发现新的菌种或亚种，如16S rRNA和ITS鉴定了脓肿分枝杆菌复合群，在进一步使用hsp65和rpoB基因后，将脓肿分枝杆菌复合群分为脓肿分枝杆菌亚种、M.bolletii亚种和M.massi-liense亚种[25]。但就鉴别能力而言，hsp65优于rpoB和ITS，16S rRNA的鉴别能力最低。然而，由于16S rRNA的相关数据库最为完整，因此建议常规使用[31-32]。为提高菌种鉴定的分辨能力，建议至少将hsp65、rpoB和ITS基因之一与16S rRNA联合使用。此外，目前应用扩增不同靶基因的商业化试剂盒来区分结核分枝杆菌和许多NTM菌种。通过将分枝杆菌特异的基因序列用探针标记，并将探针标记在固相的支持物上(如纤维素膜、芯片等)，通过检测每个探针分子与待测序列的杂交信号强度进而获取样品分子的数量和序列信息，从而达到鉴别菌种的目的[33]。但鉴定的种类有限，仅能鉴别临床中最常见的部分NTM菌种，对无法鉴定的菌种需进一步采用其他方法鉴别。

目前，基因测序是鉴定NTM菌种最正确的方法，然而鉴定到种水平有时需要分析好几个基因，并且仅限于专业实验室。最近几年，基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDL-TOF MS)方法在临床上越来越多地应用于细菌和真菌感染的研究，是鉴定NTM的潜在方法[33]。原理是在已知的NTM菌株文库中，通过比较NTM菌种特异的分子质谱类型，主要是核糖体蛋白，从而达到鉴定菌种的目的[33]。在最近研究中，通过比较MALDL-TOF MS和常规的PCR方法对NTM的鉴定，结果表明，MALDL-TOF MS是一种正确、快速和高效的方法。然而，与测序相比，MALDL-TOF MS需要的菌量较大，分辨率主要取决于数据库的质量，并且不能将脓肿分枝杆菌复合群鉴定到亚种水平[34-35]。

四、NTM耐药的分子诊断

药物敏感性试验是制定理想的治疗方案所必需的。但由于NTM的细胞壁通透性低，药物与靶位点的亲和力低及药物外排泵的作用，使得NTM对大多数抗结核药物具有天然耐药性。研究发现，NTM对某些药物的耐药性与特定耐药基因的突变有关[36]，如编码23S rRNA的rrl基因突变与大环内酯类耐药性有关，对阿米卡星药物的耐受性常与16S rRNA基因(rrs)突变有关，rpoB基因突变与利福平耐受性有关。因此，通过对药物靶基因进行测序，及时发现耐药菌株，有助于更好地制定治疗方案。

五、NTM病诊断的难点及展望

我国NTM的分布具有明显的地域差异，不同地区的感染率、发病率和流行菌种各有特点[15, 36]，而目前关于NTM流行病学资料的研究较少，又没有建立早期、快速、敏感和特异的标准化诊断技术。此外，由于样本的临床症状、放射性特征和涂片镜检的敏感度和特异度较低，培养仍然是检测的金标准。然而培养耗时，且需要使用不同类型的培养基和培养温度使细菌获得最优生长，不适于临床早期快速诊断的要求，具有一定的局限性。所以，NTM的实验室诊断方面迫切需要进行更加深入的研究。随着免疫技术和分子生物技术的发展，为NTM的鉴定提供了更快速、准确的诊断方法。虽然这些诊断方法展现了独特的优势和巨大的应用前景，但各诊断方法各有利弊，应同时通过几种不同的方法同时鉴定，克服每项技术的局限性，发挥各自优势，进而形成快速、可靠、成本低廉的标准化体系。此外，可以利用结核病领域的诊断优势来解决NTM面临的挑战。在过去几十年中，结核病及NTM病实验室诊断的重大突破之一是Xpert MTB/RIF等分子诊断技术的出现，虽然有些分子诊断技术能够将NTM与结核分枝杆菌区分开来，但不能将NTM鉴定到种水平。然而，这种进步对包括至少几种常见的NTM病原重新建立分子诊断平台提供了机会[37]，应大力加强NTM病的实验室诊断研究，诸如诊断技术、耐药机制、致病机制和组学研究，这将有助于确定种的特异性诊断标识，通过建立快速、特异的实验室诊断方法，为临床早期诊断NTM病提供更多可靠的参考依据。

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(本文编辑：薛爱华)

Strengthening laboratory diagnosis of non-tuberculosis mycobacterial disease

ZHENGHui-wen,ZHAOYan-lin.

NationalTuberculosisReferenceLaboratory,ChineseCenterforDiseaseControlandPrevention,Beijing102206,China

ZHAOYan-lin,Email:zhaoyanlin@chinatb.org

The incidence of non-tuberculous mycobacterial (NTM) disease increased year by year in the world. NTM andM.tuberculosishave similar clinical symptoms, and various species lead to a difficult diagnosis which increases the difficulty of treatment. To identify mycobacterium at species level is of great important for the diagnosis, treatment and prognostic of disease. The rapid diagnosis of modern bacteriologic method, and with the development of immunological technique and molecular biotechnology, a fast, reliable, and standardized NTM identification system would be developed.

Mycobacteria, atypical; Laboratory techniques and procedures； Diagnosis, differential

10.3969/j.issn.1000-6621.2016.09.001

102206 北京，中国疾病预防控制中心国家结核病参比实验室

赵雁林，Email：zhaoyanlin@chinatb.org

2016-08-14)