中国结核分枝杆菌表型药物敏感性试验方法标准回顾

姜广路 黄海荣



中国结核分枝杆菌表型药物敏感性试验方法标准回顾

姜广路 黄海荣

中国耐药结核病疫情依然严峻，结核分枝杆菌表型药物敏感性检测方法在耐药结核病的诊断中占有重要地位。鉴于目前国内结核病实验室检测指南中同时规定绝对浓度法和比例法为标准方法，且两者操作步骤有很大不同，对患者治疗、耐药监测造成困惑。因此，有必要了解国内耐药结核病检测方法的发展过程，以利于检测方法的规范化。作者回顾了我国结核分枝杆菌药物敏感性检测标准的历史，总结问题并提出建议，以期为结核分枝杆菌药物敏感性试验临床检测标准的优化提供有价值的信息。

分枝杆菌，结核； 结核, 抗多种药物性； 微生物敏感性试验； 参考标准

我国结核病控制目前面临的主要挑战为耐药、人口流动、MTB和HIV双重感染，其中结核病耐药问题尤为突出。自2006年开展耐多药结核病控制项目以来，结核分枝杆菌的耐药性测定日益发挥着重要作用。虽然近年来以检测耐药基因突变为手段的耐药分子诊断技术发展迅猛，但已知耐药基因突变无法完全解释结核分枝杆菌耐药现状。这就决定其无法完全替代表型药物敏感性试验(简称“药敏试验”)。细菌学检测具有直观和价廉的优点，因此，表型药敏试验仍是目前诊断结核分枝杆菌耐药的“金标准”。国内多数实验室仍主要采用以罗氏培养基为基础的结核分枝杆菌药敏试验。目前，各实验室应用的方法尚未统一，包括绝对浓度法、比例法、分枝杆菌生长指示管(Mycobacteria growth indicator tube，MGIT)法等，甚至同一实验室针对不同目的也采用了不同方法和判定标准。鉴于此，有必要对抗结核药物敏感性检测方法进行标准化。回顾我国结核分枝杆菌药敏试验方法发展的历史，有助于深入了解各种方法的由来，并对其进行优化和标准化，从而提高药敏试验结果的可靠性。

一、1963年以前中国抗结核药物的药敏试验方法回顾

异烟肼于1912年被合成，链霉素和对氨基水杨酸均在1944年被发现、合成。这些药物随之用于治疗结核病。随着药物应用范围的扩大，临床观察到的抗结核药物疗效降低的情况越来越多，了解结核分枝杆菌抗药性的临床需求越来越大，因此耐药性检测方法得以建立和发展。最初的结核分枝杆菌耐药性检测主要是针对上述3种药物。

1946年，Youmans和Williston[1]即开始对链霉素的结核分枝杆菌耐药菌株进行研究。1952年，Wilking等[2]通过对结核分枝杆菌链霉素耐药菌株的研究，将链霉素耐药界限定为10 μg/ml。1953年，中国学者何长清[3]将相关文章翻译并发表，在我国首次提出链霉素耐药界限应设定为10 μg/ml。

1954年，北京协和医院细菌免疫系王凤连教授参考Youmans、Fairbrother等的方法，开展了链霉素和异烟肼耐药性检测的研究[4]。其方法是将标本处理后直接接种于豌豆琼脂培养基，培养基中链霉素浓度分别为100、10、1、0.1 μg/ml，如发现有菌落生长报告高度耐药、中度耐药、中度敏感、高度敏感，其中低度耐药界限设定为10 μg/ml；培养基中异烟肼的浓度分别为10、1、0.1、0.01 μg/ml，其中低度耐药界限设定为1 μg/ml。这是国内开展的最早的结核分枝杆菌药敏试验。

1955年，郭均[5]使用罗氏培养基进行异烟肼间接法耐药性检测，培养基内异烟肼浓度分别为0.1、1、10、100 μg/ml，耐药界限设定为1 μg/ml，并报告了异烟肼与链霉素、异烟肼与对氨基水杨酸联合用药出现耐药较少的现象。1957年，吴绍青[6]在讨论结核分枝杆菌异烟肼耐药菌株与致病力关系中提及，英国医学研究委员会于1953年规定结核分枝杆菌药敏试验异烟肼的浓度界限为0.2 μg/ml。

二、绝对浓度法和比例法的溯源

1963年，世界卫生组织(WHO)公报提出了结核分枝杆菌药敏试验比例法、绝对浓度法、比率法等3种方法的概念[7]，并提出国际防痨联盟推荐以不加淀粉的罗氏培养基作为基础培养基。在此公报中，Gertrud Meissner(德国)提出了绝对浓度法药敏试验方法，含药培养基中药物浓度为：异烟肼浓度为0.2 μg/ml和1 μg/ml、链霉素(双氢硫酸链霉素)浓度为5 μg/ml和10 μg/ml、对氨基水杨酸浓度为0.5 μg/ml和2 μg/ml，不同的药物浓度代表细菌不同的耐药程度；耐药浓度界限为：异烟肼0.2 μg/ml、链霉素5 μg/ml、对氨基水杨酸0.5 μg/ml。培养基凝固温度为82～85 ℃，时间为40～60 min，只凝固1次。接种方法为麦氏1号管稀释50倍，取一接种环(约10 μl)接种培养基，理论上接种量为2000～10 000 个菌，即10-4mg/ml。孵育4周，如生长不良则延长1～2周。如含药培养基上菌落数的绝对数少于20个，即2000个细菌的1%，则报告敏感。文中特别提出，每个实验室制定耐药界限浓度应以实验数据为依据。

Canetti等[7-8]分别在1963年和1969年WHO 公报中2次报道了比例法药敏试验方法，该方法常规检测含药培养基中的药物浓度：异烟肼为0.2 μg/ml和1 μg/ml、链霉素(双氢硫酸链霉素)为4 μg/ml和10 μg/ml、对氨基水杨酸为0.5 μg/ml和1 μg/ml；耐药浓度界限为：异烟肼为0.2 μg/ml、链霉素(双氢硫酸链霉素)为4 μg/ml、对氨基水杨酸为0.5 μg/ml。当含药培养基上生长菌落数达到或大于对照培养基的1%时，即为耐药。如果用于研究待测菌不同药物浓度的耐药情况时，才将含药浓度范围扩大，异烟肼浓度分别为0.1、0.2、1、5 μg/ml，链霉素(双氢硫酸链霉素)分别为2、4、10、100 μg/ml，对氨基水杨酸分别为0.25、0.5、1、10 μg/ml。由此可见，从创立之初，绝对浓度法和比例法常规检测的原理和含药浓度是相同或相近的。只有用于科研时，异烟肼浓度才大于1 μg/ml，链霉素浓度可达到100 μg/ml，对氨基水杨酸浓度可达到10 μg/ml，这些浓度恰恰成为了中国绝对浓度法的药物高浓度。1969年的WHO公报又进一步明确了比例法的地位，并丰富了测定药物的种类，提出了“原发耐药、获得性耐药”的概念，并重点论述了确定浓度界限的方法[8]。这成为了1996年WHO和国际防痨和肺部疾病联合会组织的结核病耐药性监测项目中药敏试验方法的基础[7]。

1963年，《中国防痨杂志》刊登了1963年6月3日的全国结核病学术会议《关于测定结核菌对药物敏感性试验方法的意见》(简称《意见》)一文[9]，文中沿用含淀粉的罗氏培养基，间歇加热2次，分别为85 ℃ 40 min和80 ℃ 30 min，细菌接种量为0.1 mg, 即1 mg/ml接种0.1 ml，异烟肼浓度为0.1、1、10 μg/ml，链霉素(未强调使用双氢硫酸链霉素，但强调链霉素加热后易失效，要求培养基加热凝固前链霉素实际浓度双倍于规定浓度，即加入双倍量的链霉素)浓度分别为1、10、100 μg/ml，对氨基水杨酸浓度分别为0.1、1、10 μg/ml。孵育4周报告结果，是否耐药待后期与临床进行比对决定。此意见存在以下几个特点：(1)罗氏培养基含有淀粉；(2)培养基制备药物因二次加热而导致损耗大；(3)细菌接种量大；(4)含药物浓度介于WHO规定耐药界限的两侧。以上几个特点导致将来确定药物浓度界限时会选择高浓度。另外，实验室并不进行独立判定药敏试验结果，而是与临床治疗结果比对后决定，这导致后期(1996年)国内绝对浓度法的应用指南中未规定耐药判读标准，对临床医生造成一定困扰。

1964年，高东哲和郑翼宗[10-11]就结核分枝杆菌耐药性测定方法中的细菌接种量进行了研究。该研究使用的罗氏培养基仍沿用凝固2次的方法，提出了使用0.5%失水山梨醇单油酸酯聚氧乙烯醚(Tween-80)均匀液体培养基生长方法制备的菌液较玛瑙乳钵研磨法和锥形瓶玻璃珠振荡法更均匀，并认为1963年《意见》中提出的细菌接种量0.1 mg的数值过大，细菌接种量在10-3～10-4mg较为适合。

1965年，陈惠兰和王小天[12]使用11例初治患者的分离菌株，对1963年《意见》规定方法进行研究。研究中，罗氏培养基凝固2次，链霉素量加倍但效价为1，对氨基水杨酸效价为0.72；菌液浓度为1 mg/ml，分别以滴管和直径3 mm接种环接种0.1 ml 和一环(近0.01 ml)，孵育4～8周。研究结论为报告时间以4周为宜，菌量高低的影响不大，异烟肼、链霉素、对氨基水杨酸浓度界限分别为0.5、2、1 μg/ml为宜。

1980年，吴爱棣[13]对利福平耐药性方法进行研究，以确定利福平药敏试验浓度界限。研究使用的罗氏培养基凝固2次(85 ℃ 1 h，隔日后80 ℃ 1 h)，所用菌株分别来自从未用过利福平的患者(45例)，以及使用利福平1个月至3年的患者(43例)，接种量为10-3mg(10-2mg/ml接种0.1 ml)，含药培养基菌落超过10个为耐药。研究结论认为，利福平耐药的浓度界限应设定为50和200 μg/ml。

1980年，中华医学会结核病学分会总结1979年11月的“全国结核病防治学术会议”的专家意见，出版了《抗结核药物耐药性测定暂行规定》[14]，规定所用培养基为罗氏培养基，测定药物种类和浓度(单位为μg/ml)分别是：链霉素(10、100)、异烟肼(1、10)、利福平(50、250)、乙胺丁醇(5、50)、卷曲霉素(10、100)、对氨基水杨酸(1、10)、卡那霉素(10、100)、乙硫异烟胺(25、100)、环丝氨酸(50、200)、氨硫脲(10、100)，接种量为10-2mg，含药培养基生长11个菌落及以上判定为耐药，低浓度含药培养基耐药即认为耐药。特别注明制备链霉素含药培养基要加入2倍于规定浓度的链霉素，卡那霉素和卷曲霉素含药培养基加入10倍于规定浓度的药物。

中国防痨协会于1996年制定了《结核病诊断细菌学检验规程》[15]，涉及药敏试验方法的内容中去除了环丝氨酸，但链霉素仍为加入2倍量药物，卡那霉素和卷曲霉素仍为加入10倍量药物；接种量降低为10-3mg。此规程未明确指出耐药结果判定标准，最大的变更是罗氏培养基不再加热2次，但并无相应的药物浓度改变和微生物实验数据验证。中国防痨协会2006年版的《结核病诊断实验室检验规程》[16]关于绝对浓度法结核分枝杆菌耐药性测定的判读，将“耐药”定义为含药培养基上菌落生长面积达到“+”及以上，最大的变更是制备含药培养基时链霉素不再加倍，但卡那霉素和卷曲霉素仍加10倍量。许多结核病专科医院仍沿用此绝对浓度法的规程。

三、药敏试验方法的应用及比例法的引进推广

20世纪60—90年代，国内结核病实验室，包括预防体系的实验室和医疗体系的实验室，普遍应用绝对浓度法进行药敏试验，而且1990和2000年的全国结核病流行病学抽样调查细菌学检测方法均采用了绝对浓度法，其数据更便于与国内耐药数据比较。自1996年起，河南、山东等多个省份在WHO支持下开展了结核病耐药性监测项目，所采用的是基于1963年和1969年WHO公报的比例法[17]，从此比例法药敏试验开始在结核病预防体系的实验室应用。进入21世纪以来，由于结核病预防体系实验室方法进一步统一，且较多国际合作和国际交流项目的开展，促使了比例法药敏试验的普及。2007年全国结核病耐药基线调查和2010年全国结核病流行病学抽样调查采用比例法药物敏感性测定方法，其结果更便于同世界各国的耐药数据比较。

四、绝对浓度法和比例法的差异及相关研究

由于绝对浓度法和比例法同时在国内实验室应用，甚至同一实验室针对不同工作目的，采用不同方法。造成诸多耐药结果不可比较，是否统一方法也成为争论的热点，因此国内很多学者就药敏试验方法的改良、绝对浓度法和比例法一致性进行过多项研究。张莉等[18]、杨立涛等[19]、陈裕等[20]均认为最佳菌液浓度是10-2和10-4mg/ml。刘宇红等[21]研究表明，比例法和绝对浓度法药敏试验的异烟肼和乙胺丁醇结果存在明显差异，但结果有差异的菌株的最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration，MIC)均在两种方法耐药浓度界限之间。丁北川等[22]研究显示，采用WHO推荐的比例法和绝对浓度法测定的耐药结果一致，但比较WHO推荐的比例法和我国普遍采用的绝对浓度法获得的药敏试验结果，异烟肼、链霉素、乙胺丁醇、利福平等结果均有差异，且异烟肼差异明显。黎友伦等[23]研究认为，接种量10-3和10-4mg对药敏试验结果影响差异不明显。

五、绝对浓度法与比例法的差异原因分析

回顾我国绝对浓度法和比例法的发展历史，不难发现，这两种方法原理均基于细菌的MIC。两种药敏试验方法各有优缺点。比例法设计从原理上对细菌接种量进行了矫正，一定程度上减少了细菌接种量对检测结果的影响，但操作相对复杂；绝对浓度法操作简单，但容易受到细菌接种量的影响，可重复性相对要差。绝对浓度法可以认为是一种简化了浓度选择的MIC法，也可认为是一种在精确细菌接种量情况下的比例法，两种方法原理上完全相同，并无对立之处。

纵观国内结核分枝杆菌耐药性试验绝对浓度法的标准发展历史，对实验对象的选择、培养基制作、药粉的效价和加入量、细菌接种量等因素存在与WHO公报不同之处，而且变更时缺乏微生物实验数据支持。

在临床病例方面，参考WHO公报和国际防痨联盟公报，药敏试验方法的菌株来源是未治疗患者菌株和治疗失败患者菌株，确定浓度界限是能将两组菌株最大限度区分的浓度，才能被认为是源于临床并指导临床用药的实验室方法。因此，在确定药敏试验方法时，选择患者标准方面需要进一步统一。

在实验室方面，可能受间歇灭菌观念的影响，最初国内罗氏培养基凝固规定为2次，造成对温度敏感的药物在培养基制备过程中大量降解。虽然通过增加药量加以弥补，但用量增加的程度缺乏数据支持。1996年制定的《结核病诊断细菌学检验规程》[15]将罗氏培养基凝固次数改为1次，但药物浓度并未改变，导致培养基内药物含量偏高，因此实际应用中耐药率降低。药粉加倍是基于化学反应的考虑，并无微生物实验数据验证，导致与比例法的结果差异较大。

因结核分枝杆菌的细胞壁脂质较多，其在悬浊液中不易分散，早期缺乏统一的理想的细菌研磨器材。少数实验室细菌研磨使用玛瑙研钵，多数实验室使用玻璃滴管在普通玻璃试管管壁研磨，导致结核分枝杆菌分散度不够，接种后生长菌落数较少，这可能是提高接种量的原因之一。

以上因素导致国内绝对浓度法药敏试验的结果存在较大的偏差，表现为重复性差，与比例法药敏试验结果有较大差异。诸多学者对两种方法的研究表明，两种方法的差异主要原因集中于浓度界限差别较大的药物，即药物浓度差异所导致，而接种量在一定范围内变化对药敏试验结果影响不大[20-22]。

六、药敏试验方法面临挑战

第一，目前表型药敏试验方法在疾病控制体系实验室和医疗体系实验室出现两种方法并行的现象。疾病控制体系实验室多采用比例法；医院体系部分实验室采用比例法，部分实验室采用绝对浓度法。方法与结果的差异使临床医生对患者治疗产生困惑，对公共卫生医生连续比较流行病学监测数据造成困难。

第二，如前文所述，对于采用或者不采用某种药敏试验方法，多为相关规定所影响，或是WHO采用的方法，或是国内规定的方法，而国内相关规定却缺乏足够的适合我国实际情况的实验室数据的支持。

第三，即使是WHO推荐的比例法，仍有值得探讨之处。张健源等[24]研究认为，增大接种量可以发现更多耐药菌株。张楠等[25]通过检测基因突变，认为乙胺丁醇的浓度界限应从2 μg/ml降为1.6 μg/ml。

此外，目前比例法的链霉素的药物种类和浓度界限也有值得讨论之处。WHO和国际防痨和肺部疾病联合会公报最初规定的链霉素比例法药敏试验应用的药粉为双氢硫酸链霉素，耐药浓度界限为4 μg/ml。而目前因双氢硫酸链霉素不良反应大，临床已经放弃使用，制药企业已经不再生产，导致实验室难以获得双氢硫酸链霉素药物纯粉，绝大多数实验室只能以硫酸链霉素替代，这可能会导致链霉素假耐药增多。比例法链霉素药物浓度界限是否恢复到10 μg/ml，以及链霉素和乙胺丁醇实验室间质量评价符合率不高的原因值得进一步研究[26]。

第四，许多临床医生和预防人员认为药敏试验方法由实验室专家确定即可，这种观点忽略了药敏试验的实际意义，不利于耐药检测方法的建立和评估。在临床治疗和流行病学调查中涉及的耐药，则是指WHO规定的耐药标准，即“明显不同于未接触药物的野生菌株，治疗反应性下降”。而对于实验室人员，只要细菌能在含药培养基上生长，即认为是实验室耐药。两者的差异及药敏试验耗时较长的特点，导致药敏试验实际应用价值降低。

第五，针对药物敏感性检测的方法目前多集中于分子生物学的快速检测方法和液体培养基法，如文献所言，对耐药结核病的研究多注重于流行病学数据，对测定方法的基础性研究很少[27-30]。作为基础的传统固体培养基药敏试验方法仍有诸多问题没有解决。

综上所述，有必要进一步研究我国现有的耐药性检测方法与临床治疗、基因突变的相关性，确定耐药浓度界限，将耐药性检测与“治疗反应性下降”相关联，提高实验室结果对临床治疗结果的预示作用，更好地为结核病患者服务。

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(本文编辑：李敬文)

Review of the criteria on drug susceptibility test ofMycobacteriumtuberculosisin China

JIANGGuang-lu,HUANGHai-rong.

TuberculosisClinicalLaboratory,BeijingChestHospital,CapitalMedicalUniversity,Beijing101149,China

HUANGHai-rong,Email:huanghairong@tb123.org

The epidemic situation of drug-resistant tuberculosis in China is still severe．The phenotypic drug susceptibility testing ofMycobacteriumtuberculosisplays an important role in diagnosis of drug-resistant tuberculosis. A lot of differences between absolute concentration method and proportion method of domestic guideline of labora-tory testing of tuberculosis cause confusion in treatment and drug-resistance monitoring. It is necessary to know the development of drug-resistant test in China, as it is helpful to standardize the detection method. This paper reviews the history of criterion of drug susceptibility test on tuberculosis in China, summarizes problems and puts forward some suggestions, in order to provide useful information for optimization drug susceptibility test.

Mycobacteriumtuberculosis； Tuberculosis, multidrug-resistant； Microbial sensitivity tests； Reference standards

10.3969/j.issn.1000-6621.2016.09.002

101149 首都医科大学附属北京胸科医院结核病临床实验室

黄海荣，Email: huanghairong@tb123.org

2016-07-11)