静态顶空-气相色谱法用于柳叶蜡梅挥发油指纹图谱研究

静态顶空-气相色谱法用于柳叶蜡梅挥发油指纹图谱研究

梁现蕊，肖钦钦

(浙江工业大学 药学院，浙江 杭州 310014)

摘要：建立柳叶蜡梅挥发油的气相色谱指纹图谱分析方法,为全面控制柳叶蜡梅质量提供参考.采用HP-INNOWAX毛细管柱(30 m × 0.25 mm × 0.50 μm)，顶空平衡温度80 ℃，顶空平衡时间50 min，进样口温度200 ℃，检测器温度250 ℃，程序升温静态顶空-气相色谱(HS-GC)分析条件，对12批柳叶蜡梅样品进行指纹图谱分析，标定了25个共有峰,结合相似度软件、聚类分析和主成分分析对12批样品进行系统的比较与归类,将不同批次的柳叶蜡梅样品分为两类.该方法精密度好，简单快速，为柳叶蜡梅品种的鉴定与质量评估提供了可靠的依据.

关键词：柳叶蜡梅；静态顶空-气相色谱(HS-GC)；指纹图谱；挥发油；鉴别

收稿日期：2015-03-26

基金项目：国家自然科学基金资助项目(21206148)

作者简介：梁现蕊(1975—)，女，山东临沂人，副教授，博士，主要从事药物结构分析研究，E-mail: liangxrvicky@zjut.edu.cn.

中图分类号：R284.1

文献标志码：A

文章编号：1006-4303(2015)05-0567-06

Abstract:This study aimed to establish a fingerprints analysis method of volatile oil in Chimonanthus salicifolius for quality control by static headspace-gas chromatography (HS-GC). HS-GC analysis was performed on the HP-INNOWAX capillary column (30 m × 0.25 mm × 0.50 μm) with the inlet temperature at 200 ℃ and the FID detector temperature at 250 ℃. The HS oven temperature was 80 ℃, and the vial equilibration time was 50 min. The optimized method was applied to the fingerprints analysis of 12 samples and 25 characteristic peaks were picked out. The data was analyzed by chemometrics methods such as similarity analysis, hierarchical cluster analysis and principal component analysis. 12 samples were divided into 2 groups. A new, rapid and simple HS-GC fingerprint method was developed. It provides a novel strategy for the origin distinction and quality evaluation of Chimonanthus salicifolius.

Keywords:Chimonanthus salicifolius; static headspace-gas chromatography (HS-GC); fingerprints; volatile compounds; authentication

Research on the fingerprints of volatile oil inChimonanthussalicifolius

by static headspace-gas chromatography

LIANG Xianrui, XIAO Qinqin

(College of Pharmaceutical Science, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, China)

柳叶蜡梅(Chimonanthussalicifolius)系蜡梅科蜡梅属半常绿灌木川，在我国具有悠久的栽培历史和药用价值，其产地主要分布于我国江西和浙江等省[1].用柳叶蜡梅的叶片和嫩芽为原料制成的绿茶，在浙江丽水和江西婺源一带被称作“食凉茶”或“黄金茶”，具有抗菌，消炎等作用，同时对防治感冒、喉咙肿痛、慢性气管炎等也有较好的疗效[2-4].此外，柳叶蜡梅中含有丰富的挥发油成分，因此它将是精油生产的一个重要来源[4-5].然而，对于蜡梅属品种的分类研究，一直以来都存在不同的争议.目前，蜡梅属在我国中部和东南部就已有十种之多[6]，如蜡梅、山蜡梅、柳叶蜡梅、西南蜡梅、贵州蜡梅、浙江蜡梅、突托蜡梅、保康蜡梅、安徽蜡梅、簇花蜡梅.由于蜡梅品种具有十分相似的外观和香味等特点，因此很难通过其外在形态或气味将其一一区别开来.因此，作为一种重要的中药材使用时，需要建立一个准确的方法来区分这些品种，以避免造假和误用，同时也为其产地识别提供科学依据.

目前，指纹图谱技术是国际公认的控制中药质量的最常用手段，是一种综合的可量化的鉴定手段[7].但中药的指纹图谱相当复杂，为了能最大限度地获取有关物质系统的化学信息，常常将其与化学计量学技术结合起来，其应用更为准确可靠.其中，相似度评价、主成分分析与聚类分析在中药指纹图谱研究中最常使用.相似度评价是通过将谱学分析法与化学计量学处理方法相结合，建立药材的特征性指纹图谱，以其特征峰为依据对样本进行分类的一种数据分析技术，采用色谱峰面积为分析对象，保持了药材多成分信息的完整性，可为药材品质鉴定提供了较详细的信息，是指纹图谱用于药材质量评价和质量控制的一个重要环节.主成分分析是利用降维的思想，根据贡献率的大小用少数几个具有代表性的综合指标去解释原来资料中的大部分变量的多元统计分析方法.聚类分析又称群分析，是根据“物以类聚”的道理，对样品或指标进行分类的一种多元统计分析方法.化学计量学技术已经广泛地运用于中药指纹图谱的研究[8-11].静态顶空-气相色谱采用气体进样方式，其分析速度快，操作简便，几乎不需要对样品进行前处理就可以直接对液体或固体样品中挥发性成分进行分析[12-13].本实验旨在应用静态顶空-气相色谱建立柳叶蜡梅中易挥发性成分的分析方法，并结合相似度分析、聚类分析和主成分分析对不同产地、采收时间的柳叶蜡梅中易挥发性成分进行指纹图谱分析，从而为柳叶蜡梅的质量鉴定及产地判别提供依据.

1仪器与材料

1.1仪器与设备

Mettler toledo XS205DU天平(瑞士)；Agilent Technologies 6890N气相色谱仪(美国)，配有FID检测器、安捷伦化学工作站及Agilent Technologies Agilent G1888顶空进样器；Agilent Technologies 7890A气相色谱-四级杆质谱联用仪，配有EI源、MassHunter数据软件、NIST08标准谱库.

1.2试剂与材料

α-蒎烯对照品(质量分数为95%)，购于广东松林香料有限公司.

柳叶蜡梅样品分别采自于江西、浙江等地，12批样品信息如表1所示，所有样品经研磨、粉碎和过筛后放入干燥洁净的样品瓶中，保存于2～8 ℃冰箱中备用.

表1　12批柳叶蜡梅茶叶样品信息

2实验方法

2.1色谱条件

2.1.1HS-GC条件

色谱柱为毛细管色谱柱HP-INNOWAX(30 m×0.32 mm×0.5 μm)；载气：高纯氮气，流速1.0 mL/min；柱温：程序升温，初始温度50 ℃保持3 min，以10 ℃/min的速率升温至150 ℃，保持10 min，再以1 ℃/min的速率升温至160 ℃，保持6 min，最后以20 ℃/min的速率升温至220 ℃，保持17 min；进样口温度为250 ℃；FID检测器温度为280 ℃；不分流模式；顶空瓶体积20 mL；顶空平衡温度为80 ℃；顶空平衡时间50 min；进样时间为1 min.

2.1.2HS-GC/MS条件

色谱柱为毛细管色谱柱HP-INNOWAX(60 m×0.25 mm×0.25 μm)，进样口温度为200 ℃，载气为氦气，流速1.0 mL/min，进样时间1 min，EI源温度230 ℃，电压70 eV，质量扫描范围30～550 amu，程序升温和顶空条件同2.1.1.

2.2对照品溶液的制备

取α-蒎烯对照品5 mg，精密称定，至于50 mL容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度.精密量取上述溶液0.2 mL至20 mL顶空瓶中，加入1.8 mL水，压盖密封，即得.

2.3供试品溶液的制备

取柳叶蜡梅粉末300 mg，精密称定，置于20 mL顶空瓶中,加水2 mL,压盖密封，即得供试品溶液.

3结果与讨论

3.1方法重复性、精密度和柳叶蜡梅供试品稳定性

取S3批次柳叶蜡梅样品6份，按2.3方法制备供试品溶液，按2.1.1 HS-GC条件进样测定进行重复性考察.结果显示25个共有峰的峰面积RSD在3.3%～4.9%范围内，说明该方法重复性好.取同一批次样品5份，分别于第1天和第2天进行试验，按2.3方法制备供试品溶液，按2.1.1 HS-GC条件进样测定进行精密度考察.结果显示25个共有峰的峰面积RSD(n=10)在2.4%～5.0%范围内，说明仪器精密度良好.取同一批次样品8份，按2.3方法制备供试品溶液，按2.1.1 HS-GC条件，分别在0，2，4，8，12，20，24和48 h进样测定进行稳定性考察.结果表明：柳叶蜡梅供试品溶液在24 h内25个共有峰的峰面积RSD均小于5.0%，但从色谱图上来看，样品在20 h后出现了两个新物质，因此样品溶液在20 h内是稳定的.

3.2指纹图谱的建立

3.2.1指纹图谱共有模式的建立及相似度评价

取12批柳叶蜡梅样品，按2.3方法制备供试品溶液，按2.1.1 HS-GC条件依次进样测定，记录GC色谱图，12批样品的GC色谱图如图1所示.将12批柳叶蜡梅挥发油的GC图谱以AIA格式依次导入国家药典委员会中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件(2004 A版)进行分析，以S1批柳叶蜡梅GC谱图为参照谱图进行指纹匹配，确定了25个共有峰，生成共有模式指纹图谱，如图2所示，其中，以峰18在图谱中较稳定，峰面积较大，与各峰分离良好，又为所有样品共有，因此确定峰18为参照峰(S)，则其余各共有峰与峰18的相对保留时间RSD见表2.同时进行各批次样品与对照指纹图谱之间的相似度计算，以夹角余弦法为测度，12批样品相似度结果依次为：0.964，0.879，0.745，0.870，0.931，0.967，0.897，0.912，0.936，0.916，0.995，0.903.

图1　12批柳叶蜡梅挥发油的HS-GC指纹图谱 Fig.1　HS-GC fingerprint of 12 batches of volatile oil in Chimonanthus salicifolius

图2　柳叶蜡梅挥发油的HS-GC指纹图谱共有模式及共有峰标识 Fig.2　Mutual modes and common peaks of HS-GC fingerprint of volatile oil in Chimonanthus salicifolius

编号相对保留时间S1S2S3S4S5S6S7S8S9S10S11S12RSD/%10.2730.2730.2730.2730.2740.2730.2730.2740.2730.2730.2730.2730.09020.2930.2930.2930.2930.2930.2930.2930.2930.2930.2930.2930.2930.07230.3450.3460.3460.3460.3460.3460.3460.3460.3460.3460.3460.3460.04040.3720.3720.3720.3720.3730.3720.3720.3720.3720.3720.3720.3720.04750.3820.3820.3820.3820.3820.3820.3820.3820.3820.3820.3820.3820.04160.4220.4220.4220.4220.4220.4220.4220.4220.4220.4220.4220.4220.04570.4360.4360.4360.4360.4360.4360.4360.4360.4360.4360.4360.4360.04380.4560.4540.4550.4560.4530.4540.4550.4540.4550.4550.4560.4560.24490.4660.4640.4650.4660.4630.4640.4660.4640.4650.4650.4660.4660.233100.5010.4990.5000.5010.4980.4990.5000.4990.5000.5000.5010.5010.248110.5450.5430.5440.5440.5420.5430.5440.5430.5440.5440.5440.5440.171120.5600.5590.5600.5600.5590.5590.5600.5590.5590.5600.5600.5600.065130.5880.5870.5880.5880.5860.5860.5880.5870.5870.5880.5880.5880.112140.7770.7780.7760.7760.7770.7750.7760.7780.7760.7780.7760.7760.117150.8400.8400.8400.8400.8400.8400.8400.8400.8400.8400.8400.8400.019160.8940.8940.8930.8940.8940.8940.8930.8940.8930.8940.8940.8940.047170.9680.9680.9680.9680.9680.9680.9680.9680.9680.9680.9680.9680.013181.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0000.000191.1361.1361.1361.1361.1361.1361.1361.1361.1361.1361.1361.1360.013201.2191.2201.2151.2191.2201.2191.2191.2191.2191.2191.2191.2190.098211.2381.2381.2381.2381.2381.2381.2381.2381.2381.2381.2381.2380.016221.2791.2801.2801.2791.2791.2791.2791.2801.2791.2791.2791.2790.039231.3201.3201.3201.3201.3201.3191.3201.3201.3191.3201.3191.3190.028241.3371.3371.3371.3371.3371.3371.3381.3371.3361.3371.3371.3370.030252.1622.1632.1642.1632.1642.1632.1632.1622.1632.1622.1632.1630.034

一般情况下，当相似性低于0.800，认为两个样品之间有很大的不同.因此，从相似度结果来看，采收年份最早的S3与其他样品差异较大，说明采收年份对柳叶腊梅挥发油成分有一定的影响.对于同一地区的样品，产自江西的5批样品之间质量差异较小，产自浙江开化的7批样品之间相似性差异也较小，除S3.通常，样品中的挥发性成分易受储藏条件与存放时间的影响而导致其某些挥发性成分质量分数的变化[7,11]，同时也受采收时间的影响，如S3批样品因采收时间早于所有其他批次的样品，且一直存放于室温条件下而导致其与其他批次样品差距较大.

3.2.2共有峰的归属

取S1批柳叶蜡梅样品，按2.3方法制备供试品溶液，按2.1.2 HS-GC/MS条件进样分析，采用对照品对照与NIST08标准谱库对柳叶蜡梅挥发油指纹图谱中的25个共有色谱峰进行归属.各共有峰经HS-GC/MS鉴定结果示见表3，谱库检索匹配度均大于90%，因此柳叶蜡梅茶叶中主要含有α-蒎烯、桉油精、石竹烯、α-石竹烯、D-大根香叶烯和(-)-b-杜松烯等挥发性成分.从表3中可看出：12批样品25个共有特征峰的相对峰面积(以峰18为参照峰)变化较大，表明不同批次柳叶和蜡梅之间化学成分的质量分数存在一定差异.

表3　柳叶蜡梅指纹图谱共有峰的成分分析

3.3聚类分析

为了能更全面地了解柳叶蜡梅样品的质量和品种之间的差异性，以柳叶蜡梅GC图谱中25个特征峰的相对峰面积(以峰18为参照峰)为指标，采用SPSS19.0数据分析软件对12批柳叶蜡梅样品进行聚类分析.将相似度分析所得12批样品的匹配数据中25个共有峰的相对峰面积导入该软件中，得到一个A12×25(12批样品和25个共有峰)的数据矩阵.聚类分析采用组间联接法，平方Euclidean距离作为聚类对象相似度的距离公式，得到柳叶蜡梅样品系统聚类树状图如图3所示，从图3中可清楚地看出：S3批样品与其他批次距离较远，若将12批样品分为两大类，则S3可为第Ι类，其他11批样品可为ΙΙ类.两个样本之间的距离越短，它们的相似度就越高，质量差异就越小.因此，该结果表明S3批次样品与其他批次样品的质量之间存在明显差异，这与相似度评价结果是一致的.

图3　12批柳叶蜡梅样品使用平均联接的树状图 Fig.3　Dendrogram clustering of 12 Chimonanthus salicifolius samples

3.4主成分分析

以柳叶蜡梅GC图谱中25个特征峰的相对峰面积为指标，采用SPSS19.0软件对12批柳叶蜡梅样品进行主成分分析.基于特征值>1为抽取标准，得到前两个主成分的累积方差贡献率为92.0%(第一主成分的贡献率为82.4%，第二主成分的贡献率为9.6%)，它代表了柳叶蜡梅样品中25个元素质量分数的92.0%的信息量，具有较好的代表性，说明主成分分析法在该研究中适用，降维成功，因此选取前2个主成分即可进行评价.12批柳叶蜡梅样品的主成分得分图如图4所示，依据各样品在主成分得分散点图上的位置，我们同样可以看到点S3与其他多点聚集中心的距离偏离较远，因此，该结果与聚类分析结果是一致的.

图4　12批柳叶蜡梅样品的主成分得分图 Fig.4　Scatter plot of 12 Chimonanthus salicifolius samples

4结论

应用静态顶空-气相色谱法建立了柳叶蜡梅挥发油的专属性指纹图谱，该方法简单快速，无需复杂的样品前处理过程，样品用量少，精密度好，可用于柳叶蜡梅挥发油的指纹图谱分析.结合相似度分析、聚类分析和主成分分析等方法，对12批样品的质量进行了系统比较与分类研究，结果表明：12柳叶蜡梅样品可分为两大类，其中采收年份最早的S3批样品为第Ι类，其他11批样品为第ΙΙ类，说明不同产地的柳叶蜡梅之间质量差异较小，而采收时间与存放时间对其质量影响较为明显，三种分析方法得到一致的结论，说明建立的柳叶蜡梅挥发油的指纹图谱分析方法可靠，可为柳叶蜡梅的香气评价、质量控制和产地识别等方面提供科学依据.

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(责任编辑：刘岩)