BAPTA-AM脂质体抗大鼠重症急性胰腺炎的作用

BAPTA-AM脂质体抗大鼠重症急性胰腺炎的作用

宋必卫，郑彩云，俞巧丽

(浙江工业大学 药学院，浙江 杭州 310014)

摘要：为观察BAPTA-AM脂质体(BA-L)抗重症急性胰腺炎(SAP)的作用，采用胰胆管逆行注射4%牛黄胆酸钠(TC)制作大鼠SAP模型.BA-L治疗组于造模后立即尾静脉注射相应剂量BA-L，给药24 h后，观察各组大鼠的死亡情况，检测各组大鼠血清AMS，LDH，TNF-α水平以及胰腺组织匀浆MDA水平及SOD活性，HE染色观察胰腺组织病理学改变.结果表明：给予BA-L治疗后SAP大鼠死亡率明显降低，血清AMS，LDH，TNF-α水平和胰腺组织匀浆MDA水平显著降低，SOD活性增高，HE染色组织切片显示BA-L明显减轻胰腺组织损伤.表明BA-L能显著减轻大鼠SAP，为开发BA-L成临床SAP治疗新药物提供必要的药效学依据.

关键词：BAPTA-AM；急性胰腺炎；Ca`(2+)；TNF-α

收稿日期：2015-04-17

作者简介：宋必卫(1956—)，男，安徽岳西人，教授，研究方向为神经分子药理学，E-mail:bwsong@zjut.edu.cn.

中图分类号：R965

文献标志码：A

文章编号：1006-4303(2015)05-0562-05

Abstract:To explore the protective effect of BAPTA-AM liposome (BA-L) on severe acute pancreatitis (SAP), a rat SAP model was established by retrograde injection of 4% sodium taurocholate (TC) into pancreatic duct. After modeling, BA-L groups were immediately administered BA-L in different doses. After 24 h of BA-L administration, the mortality of rats, serum AMS, LDH and TNF-α levels, tissue MDA and SOD levels were detected. Pathological changes of pancreatic tissue were examined. The results show that BA-L could significantly reduce the mortality compared to the modeling. A comparison of the modeling groups shows that the AMS, LDH, TNF-α and MDA levels of the BA-L group were reduced remarkably, however, the SOD activity was increased significantly. These changes were also associated with parallel changes in histopathological appearance. In conclusion: The results above demonstrated that BA-L can exert an admirable protection against TC induced SAP in rats. The study also provides the essential therapeutic basis for BA-L to be developed as an anti-SAP drug.

Keywords:BAPTA-AM; acute pancreatitis; Ca`(2+); TNF-α

Protective effect of BAPTA-AM liposome on severe acute pancreatitis in rats

SONG Biwei, ZHENG Caiyun, YU Qiaoli

(College of Pharmaceutical Science, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, China)

急性胰腺炎是临床较为多见的急腹症之一，是由多种病因引发的胰酶在胰腺内部被异常激活后，继发胰腺组织自身消化、水肿、出血甚至坏死的一系列炎症反应.其发病率呈逐年上升趋势，大部分急性胰腺炎患者病情具有自限性，预后良好；但有20%～30%的患者可进展为重症急性胰腺炎(Severe acute pancreatitis，SAP)，SAP可引发全身炎症反应综合征(Systemic inflammatory response syndrome，SIRS)，以致多器官功能障碍综合征(Multiple organ dysfunction syndrome，MODS)，甚至是多器官功能衰竭(Multiple system organ failure，MSOF)，从而导致死亡[1-2].目前，临床SAP治疗效果差，仍缺乏针对发病因素、能很好保护胰腺细胞特效治疗药物，SAP病死率仍然高达10%～30%[3].SAP的发病机制极其复杂，诱因诸多，如胆道疾病、内分泌与代谢障碍、大量饮酒与暴饮暴食、胰管阻塞、药物、手术创伤等[4].目前认为腺泡细胞Ca2+超载、溶酶体水解酶特别是组织蛋白酶B释放、微循环障碍致缺血缺氧-再灌注损伤、TNF-α等炎症因子释放，是SAP发生发展的主要分子机制[5].

Ca2+作为细胞内重要的第二信使，在胰腺腺泡细胞的生理与病理过程中起重要作用，细胞内Ca2+超载是造成SAP的一个重要因素[6-7].BAPTA[1,2-bis(o-aminophenoxy)ethane-N,N,-Nc,Nc-tetraaceticacid;1,2,双-邻氨苯氧乙烷基-N,N,-Nc,Nc-四乙酸]是目前国际上实验室常用的Ca2+络合剂，其乙酰氧甲基化物(BAPTA-AM)极易进入细胞，在细胞内被酯酶水解后释放BAPTA，消除细胞内Ca2+超载，调节钙稳态[8].本课题组通过大量的研究发现：BAPTA-AM对正常人肝细胞(L-02)、人肝癌细胞(HepG-2)、犬肾小管细胞(MDCK)和神经细胞等细胞具有很好的保护作用，能大幅度降低细胞死亡，提高细胞存活率[9-11]；整体实验研究已证明BAPTA-AM脂质体(BAPTA-AM liposome，BA-L)对小鼠急性肝衰竭、大鼠急性肾损伤都有良好的治疗作用[12-13].以此为依据，本研究通过建立实验性大鼠SAP模型，观察BA-L抗SAP的作用及机制.

1材料与方法

1.1药品与试剂

BA-L(粒径125～130 nm)合肥恒星科技开发有限公司提供；牛黄胆酸钠(Sodium taurocholate，TC)，批号101388587，购自美国Sigma公司；肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factor alpha，TNF-α)ELISA试剂盒，批号24010981024，由武汉博士德生物工程有限公司提供；淀粉酶(Amylase，AMS)试剂盒，批号20141210，乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase，LDH)试剂盒，批号20141211，超氧化物歧化酶(Superoxide dismutese，SOD)试剂盒，批号20141208，考马斯亮蓝试剂盒，批号20141212，丙二醛(Malondialdehyde，MDA)试剂盒，批号20141211，均由南京建成生物工程研究所提供.

1.2实验动物

采用清洁级健康SD雄性大鼠，体重约220～250 g，购自浙江省医学科学院动物中心.动物许可证号：scxk(浙)20140001.

1.3分组与给药

随机将大鼠分为正常组(control)，伪手术组(sham)，模型组(model)，BA-L分3个剂量给药组(剂量分别为98，140，200 μg/kg)，每组8只(不包含死亡率检测).SAP造模后，给药组立即尾静脉注射(按0.05 mL/kg的容积给药)相应剂量BA-L，正常组、伪手术组和模型组分别尾静脉注射等体积的生理盐水.

1.4大鼠SAP模型的制备

大鼠实验前12 h禁食不禁水，用10%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔注射麻醉，依照Aho和郝建志等的方法复制SAP模型[14-15]：腹部剃毛消毒后，于剑突下正中切开2 cm开腹.进腹沿着胃向下1～2 cm处找到十二指肠系膜缘处的胰腺，胰腺中间可见透明胰管.用手食指托起中段十二指肠，找到肠管壁内潜在的十二指肠大乳头，用注射针头于十二指肠外侧壁无血管区域扎一个小孔，再用胆管插管从小孔进入肠管后再沿着乳头方向探入胆胰管内，并与胆胰管呈平行方向平行推入1 cm，再用无创血管镊夹住固定，同时在肝门下的肝管汇合处，用另一无创血管镊夹闭肝总管.以匀速缓慢注入4%牛黄胆酸钠溶液(1 mL/kg)，随即可见胰腺呈弥漫性红肿.滞留5 min后拔去胆管插管，松开无创血管镊，消毒针口后逐层缝合关腹.伪手术组不注射4%牛黄胆酸钠溶液，仅作开腹及做针头穿刺动作.

1.5大鼠血液和组织样本的采集

给药后24 h，通过腹腔注射水合氯醛麻醉大鼠，经左颈总动脉取血.血液用离心机3 000 r/min离心10 min获取血清，分装于Eppendorf管-20 ℃冷冻保存，用于血清AMS，LDH，TNF-α检测.取血后立即取胰腺组织，用4 ℃的生理盐水洗去表面血液，取胰腺组织的尾部以PH值为7.2±0.1的PBS为介质，制备10%的组织匀浆，按试剂盒操作步骤检测MDA水平和SOD活性.

1.6胰腺组织的病理学改变

取同一部位胰腺组织，置于10%的福尔马林溶液固定至少24 h以上，常规石蜡包埋，制成厚度为4 μm的切片，用乙醇梯度脱水，二甲苯透明，最后HE染色.依照Rongione等[16]的标准，在200 倍光镜下观察胰腺组织病理学改变，随机选取8个视野，从组织水肿、炎症浸润、细胞坏死、出血四个方面的损伤轻重程度，进行组织病理评分.

1.7统计学分析

实验数据采用Graphpad Prism 5.0软件处理，数据用Mean±S.E.M表示，除特别说明之外，其余实验数据均采用One way ANOVA检验均数显著性差异，以P<0.05为有显著性差异.

2结果

2.1BA-L对SAP大鼠死亡率的影响

SAP大鼠死亡率(24 h)见表1，采用Chi-square test检验均数显著性差异，伪手术组与正常对照组均无大鼠死亡，而模型组死亡率高达37.5%，给药组除了低剂量组有1例死亡外，中剂量和高剂量均无大鼠死亡.提示BA-L可降低SAP大鼠死亡率.

表1　BA-L降低SAP大鼠(24 h)死亡率 1)

注：1) 与模型组比较，*P<0.05.

2.2BA-L降低SAP大鼠血清AMS活性和LDH水平

SAP的特异性血清AMS活性和非特异性LDH水平见图1和图2，与正常组比较，伪手术组指标无显著差异；模型组血清AMS活性和LDH水平均显著性升高(P<0.001)，提示大鼠胰腺损伤明显.不同剂量的BA-L给药组血清AMS均极其显著降低(P<0.001)，当剂量为140 μg/kg时，效果最佳，进一步加大剂量为200 μg/kg则无进一步降低趋势.BA-L在140 μg/kg剂量时，抑制SAP引起LDH释放(P<0.01)的效果最明显，SAP引起的LDH释放为各组实验值减去正常组均值.

与正常组比较， ###P<0.001；与模型组比较， ***P<0.001 图1　BA-L降低SAP大鼠血清AMS活性 Fig.1　BA-L lowered the serum activities of AMS in rats with SAP

与模型组比较， *P<0.05， **P<0.01 图2　BA-L抑制SAP引起的LDH释放 Fig.2　BA-L inhibited LDH release induced by SAP

2.3BA-L减轻SAP大鼠胰腺组织氧化损伤

胰腺组织MDA水平、SOD活性测定结果见表2，模型组MDA水平显著增高(P<0.001)，同时SOD活性明显降低(P<0.001).BA-L治疗显著降低MDA水平(P<0.001)，恢复SOD活性.结果显示：模型组MDA水平显著上升，同时SOD活性降低，提示氧化损伤参与了SAP的发病过程；BA-L可抗氧化损伤，起保护胰腺的作用，并存在一定的剂量依赖性趋势.

表2　BA-L抗SAP大鼠胰腺组织匀浆氧化

注：1) 与正常组比较，###P<0.001；与模型组比较，**P<0.01，***P<0.001.

2.4BA-L改善SAP大鼠胰腺病理学变化

综合以上实验的结果，选取BA-L 140 μg/kg剂量组的胰腺组织进行HE染色，200倍光镜下随机选择8个视野观察大鼠胰腺组织病理学变化(图3)，按组织坏死、出血、炎症、水肿4个方面进行病理学评分.图3(a,b)胰腺结构清晰，形态完整，间质无渗出，无明显的炎症渗出，无出血与坏死.图3(c)结构模糊不清，胰闰管和小叶间导管极显著扩张，胰腺间质明显水肿，炎症细胞浸润，小叶有大量弥漫性出血及坏死.图3(d)与模型组相比，胰腺结构清晰，病变明显减轻，可见小叶间水肿，少量炎症细胞浸润，个别有出血及坏死现象.病理学评分(表3)可见：模型组得分相比正常对照组明显增高，胰腺损伤程度很重；BA-L治疗组的得分显著减低，表明损伤较轻.

表3　大鼠胰腺组织损伤病理学评分(HE染色)

注：1) 与正常组比较，###P<0.001；与模型组比较，***P<0.001.

图3　BA-L改善SAP大鼠胰腺组织病理学变化 Fig.3　BA-L ameliorated the injury of pancreatic tissue

2.5BA-L降低血清TNF-ɑ水平

1.1 对象 2011年1—6月在我科住院且使用静脉留置针的老年患者300例，按住院号的单双分为实验组和对照组各150例，两组患者性别、年龄、文化程度、病种、静脉条件和用药情况比较差异无统计学意义(P＞0.05)，具有可比性。

血清TNF-ɑ水平见图4.模型组水平是正常组的4倍以上(P<0.001)；与模型组比较，BA-L各给药组TNF-ɑ表达水平均极明显下降；当BA-L剂量为140 μg/kg时，TNF-ɑ表达水平降低尤为明显.

与正常组比较， ###P<0.001；与模型组比较， ***P<0.001 图4　BA-L降低SAP大鼠血清TNF-α水平 Fig.4　BA-L decreased the serum levels of TNF-α in rats with SAP

3讨论

多种诱因均可导致SAP，如胆源性、酒精性及高脂血症等，目前没有特效的治疗方法.当SAP发生时，常伴有血钙降低，提示SAP时胰腺损伤与Ca2+水平异常有关.近年来，Ca2+在SAP病理生理学过程中的作用研究是SAP领域研究焦点之一，细胞内Ca2+超载被普遍认为是导致胰腺腺泡细胞死亡的关键因素[17].Wittel等[18]的研究显示在大鼠SAP模型中，腺泡细胞内Ca2+浓度升高，可导致胰腺水肿和坏死.Dante等[19]动态观察了胰腺组织中的Ca2+浓度的变化，发现在SAP的早期，胰腺组织中就有Ca2+的异常聚集，并且随着疾病的发展而加重.这是由于在多种致病因素的相互作用下，破坏了细胞膜的完整性，细胞外的Ca2+可以通过异常开放的Ca2+通道流入细胞内，从而造成胰腺腺泡细胞内Ca2+超载.体外实验也证实SAP时细胞内Ca2+持续升高，且与SAP 的严重度正相关[20].Mooren等[21]分别结扎了大鼠和小鼠的胰管造成SAP模型，测得胰腺细胞内Ca2+明显升高，细胞内钙稳态遭到破坏.腹腔给与钙络合剂预处理，可抑制大SAP模型鼠胰腺细胞内Ca2+升高，证实细胞内Ca2+信号变化直接参与了SAP的发生发展.BAPTA-AM是极易进入细胞的Ca2+络合剂，在胞内被酯酶水解后释放BAPTA，消除细胞内Ca2+超载，达到调节钙稳态的目的.本实验采用逆行胰胆管注射4%牛黄胆酸钠建立大鼠SAP模型，探索BAPTA-AM抗SAP的作用.

胰腺是一个有内、外分泌功能的重要器官，它的生理和病理变化都与生命息息相关.AMS主要由唾液腺和胰腺分泌.其功能主要是能分解多糖，如淀粉和糖原.血清AMS升高最多见于SAP.当SAP发生时，AMS升高，临床上一般都用AMS作为重症急性胰腺炎诊断的首选指标.LDH是细胞破裂的非特异标志物，在胰腺损伤过程中释放[22].MDA是自由基引发的脂质过氧化过程中合成的醛类物质，其含量高低反映了机体内氧化损伤程度.SOD可通过清除体内氧自由基，发挥抗氧化作用来保护细胞.TNF-α是造成胰腺损伤的主要炎症因子，是胰腺炎症事件中最早起作用的因素之一.TNF-α与TNF受体结合，激活死亡受体通路，分别能引起胰腺细胞和毛细血管内皮细胞细胞凋亡、程序性坏死，并通过激活NF-κB通路引起炎症反应[23-24].本实验中，正常组和伪手术组AMS活性、TNF-α水平、氧化应激指标以及组织形态学特征几乎未见异常，表明实验手术过程未对胰腺造成任何损伤.SAP模型组中血清AMS，LDH活性和TNF-α水平急剧增高、严重的氧化损伤及形态学特征变化等表明了动物模型的成功.给予BA-L治疗后大鼠各项指标水平明显降低，表明BA-L具有胰腺保护作用，并能显著减轻SAP大鼠胰腺损伤，其作用机制可能与抗氧化损伤、减少TNF-α表达有关，开发前景良好.

4结论

研究首次证明BA-L静脉注射给药，能显著减轻SAP大鼠胰腺损伤.在剂量为140 μg/kg时效果最佳，单次给药疗效可维持24 h以上，证明BA-L有良好的抗SAP功效.BA-L抗SAP机制可能与抗氧化损伤，减少TNF-α表达有关.实验给药时间是在SAP大鼠造模成功后，属于治疗用药，故实验结果比一般的预防用药更符合临床的治疗实际，为BA-L开发成SAP治疗药物提供了一条全新思路.

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(责任编辑：刘岩)