甾体类化合物生物转化的研究进展

甾体类化合物生物转化的研究进展

王鸿，周峰，吴祺豪，陈苏

(浙江工业大学 药学院，浙江 杭州 310014)

摘要：甾体类化合物是一类广泛存在于动植物体内，具有多种生物活性的物质，它的生物转化指的是外源甾体类化合物在生物体内经多种酶催化的代谢转化，通过生物转化可以完成一些有机合成难以进行的反应，得到更具有新药开发价值的物质.近5年来，甾体类化合物的生物转化研究发展迅速，在查阅相关国内外文献的基础上，归纳了甾体类化合物生物转化的不同类型，羟化反应，氢化反应，脱氢反应，Baeyer-Villiger氧化反应和溴化反应，阐述了甾体类化合物生物转化的相关实例和研究进展，为进一步研究甾体类化合物的结构改造和修饰提供了参考.

关键词：生物转化；甾体；结构修饰

收稿日期：2015-03-16

基金项目：国家自然科学基金资助项目(30973681)；浙江省大学生科技创新活动计划暨新苗人才计划(2015R403083)

作者简介：王鸿(1972—)，女，黑龙江齐齐哈尔人，教授，博士生导师，研究方向为药学，E-mail: hongw@zjut.edu.cn.

中图分类号：Q815

文献标志码：A

文章编号：1006-4303(2015)05-0556-06

Abstract:Steroids widely exist in animals and plants, with a variety of biological activities. Biotransformation of steroids achieve structural modifications of substrates with the functions of enzymes systems in organism and accomplish some reactions that organic synthesis can not achieve. Substances with drug development value are produced by biotransformation. The latest five-year show a rapid development in the academic research on biotransformation of steroids. This review mainly focuses on biotransformation of steroids in the past 5 years. On the basis of consulting a large number of foreign and domestic studies, biotransformation patterns are summarized to 5 types, hydroxylation, carbonylation, hydrogenation, dehydrogenation, Baeyer-Villiger oxidation and bromination. Relevant examples and research progress of biotransformation are elaborated, which plays an important role in structural modification of steroids and provids research basis for steroids biotransformation.

Keywords:biotransformation; steroids; structural modification

Recent advances in steroid biotransformation

WANG Hong, ZHOU Feng, WU Qihao, CHEN Su

(College of Pharmaceutical Science, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, China)

甾体类化合物结构多样，种类众多，并且其中很多化合物在生命活动中扮演着至关重要的角色，例如：胆固醇、胆汁酸、性激素、维生素D、心脏苷配基、抗生素、和昆虫蜕皮激素等等[1].甾体类化合物在医药领域中应用也非常广泛，主要用于抗炎、抗毒、抗过敏、抗休克等，能治疗或缓解胶原性疾病和过敏性休克，也可用于治疗阿狄森氏病等内分泌疾病，还是治疗乳腺癌和前列腺癌重要的辅助治疗药物[2].

随着对甾体类化合物研究的深入，甾体化合物的衍生物逐渐被发掘.诸多研究表明：通过化学合成或者生物转化的方法能够对甾体结构进行修饰，而甾体结构细小的变化，都能够对其生物活性产生巨大的变化.相较于传统化学合成的方法，生物转化在特征官能团的引入，以及化合物的结构修饰，更为有效且更加环保[3].1952年Murray等[4]利用了黑根霉(Rhizopusnigricans)对孕酮进行转化，仅仅只用了一步，就在C11位上引入了羟基，从而使孕酮合成皮质酮反应减少至只需三步.这一发现引发了巨大轰动，许多微生物学者、有机化学家和药物学家们开始了大量的微生物转化研究工作.

1羟化反应

羟基化反应(Hydroxylation)指的是在有机分子上引入羟基的反应，甾体类化合物通过羟基化修饰后，一般会影响其药理活性.常见的有机化学合成手段几乎不能进行这样的直接羟化反应，然而在生物转化中，这种C-H键的羟化是一种非常常见并且重要的生物转化反应.雌烷、孕烷、雄烷等具有甾体母核的化合物的微生物转化羟基化常出现在特定的位置，羟基化常是由根霉(Rhizopus)、曲霉(Aspergillus)、链霉(Streptomyces)等微生物实现.甾体的羟基化衍生物是医药产品的一个重要组成部分，他们被广泛应用于癌症、炎症和HIV等多种疾病的治疗中.因此，甾体类物质的羟基化是生物转化中一个最重要的部分.目前的研究主要侧重于11α，11β以及16α的羟基化，这三种微生物羟化反应对于甾体类化合物的工业化，存在巨大的经济效益[5].通过微生物对甾体母核不同位点的羟基化，对甾体进行修饰，产生结构多样的甾体衍生物，同时能够改变甾体化合物的生物活性.

黄体酮也称孕酮，是由卵巢黄体分泌的一种天然孕激素，是重要的药物中间体.作为微生物转化的首例，是甾体生物转化中的典型例子，近期的诸多研究仍以其作为底物进行微生物转化.Kolet等[6]利用毛霉菌(Mucorhiemalis)转化黄体酮获得三种产物：14α-羟基黄体酮，6β,14α-二羟基黄体酮，7α,14α-二羟基黄体酮，转化率高达94%，该研究通过对黄体酮的微生物转化，产生了多种具有工业开发潜力的羟基化黄体酮衍生物.同时，该菌株对于另一个甾体药物睾酮，也能够进行羟基转化.睾酮又称睾丸素，能够维持肌肉、骨质强度，能够影响人体系统和功能，通过转化，共获得4种羟基化产物：14α-羟基睾酮，7α,14α-二羟基睾酮，6β,14α-二羟基睾酮，14α-羟基-4-雄甾烯-3,17-二酮.在之前研究中，Kolet等[7]采用同属的毛霉菌M881菌株，对黄体酮(I)进行了生物转化研究，通过对黄体酮的5 L规模放大转化实验，证明M881菌株在大规模生产中，能将黄体酮进行6β，11α双羟基化，产生转化产物：11α-羟基黄体酮(II)，6β,11α-双羟基黄体酮(III)，6β-羟基孕甾-4-烯-3,11,20-三酮(IV)，如转化反应式

对于黄体酮生物转化的研究表明：微生物转化是用于产生多种甾体类衍生物的一个重要途径，在活性医药中间体发掘过程中具有重大意义，大量的发酵实验也表明了微生物在甾体类化合物大规模转化应用中的可行性.和黄体酮生物转化相似，目前对于甾体化合物生物转化研究一方面通过对底物的修饰，获得重要的药物生产中间体或底物衍生物；另一方面通过结构的改变，阐明甾体结构和生物活性之间的关系.双醋炔诺醇是一种半合成的甾体类药物，作用同炔诺酮，临床上作为一种口服避孕药.它能抑制排卵过程，是一个强有力的孕酮，它结合雌激素对月经产生了适当的周期性的控制.甚至，在低剂量时能够起到完整避孕作用.Zafar等[8]采用雅致小克银汉霉菌(Cunninghamellaelegans)对双醋炔诺醇(V)进行了微生物转化，获得了三个新型羟基化产物17α-乙炔雌-4-烯-3β,17β-二乙酰氧基-6α-醇(VI)，17α-乙炔雌-4-烯-3β,17β-乙炔雌二乙酰氧基-6β-醇(VII)，17α-乙炔雌-4-烯-3β,17β-乙炔雌二乙酰氧基-10β-醇(VIII)，其转化反应式为

氢化可的松是一种人工合成的，也是天然存在的糖皮质激素，具有明显的抗炎作用、免疫抑制作用、抗休克、抗毒作用及一定的盐皮质激素活性，它常被作为抗炎和抗过敏药物，Restaino等[9]采用玫瑰产色链霉菌(Streptomycesroseochromogenes)对氢化可的松进行了C16位的α-羟基化，获得生产抗炎药物丙缩羟强龙的重要中间体16α-羟基氢化可的松.

在生物转化甾体化合物的研究中，利用结构修饰，获得更多新型的化合物是研究的重点之一，诸多的甾体药物或者药物中间体经过微生物羟基化修饰后，也都体现了一定程度的生物活性变化.醋酸美仑孕酮是一种用于促进饲养场动物生长的饲料添加剂，它能够提高饲料吸收效率，促进肌肉快速增长.对于人体而言，它能够促进卵巢发育.以小鼠为实验样本的研究中发现，它具有类似于氢化可的松的抗炎效果.Schiffer等[10]通过利用短刺小克银汉霉(Cunninghamellablakesleeana)，将醋酸美仑孕酮转化成为一种新型化合物：17α-乙酰氧基-11β-羟基-6-甲基-16-亚甲基孕甾-4,6-二烯-3,20-二酮，并进行了T细胞抗炎实验，结果表明该化合物具有潜在的抗炎活性，具有临床应用价值.

诺龙是一种常见的兴奋剂，可用于治疗营养缺乏，消瘦或用于严重烧伤和动过手术的患者.Baydoun[11]等利用刺孢小克银汉霉(Cunninghamellaechinulata)和短刺小克银汉霉(C.blakesleeana)，以诺龙为底物进行生物转化，最终获得了3个新型羟基化诺龙衍生物，10β,12β,17β-三羟基-19-去甲基-4-雄烯-3-酮，10β,16α,17β-三羟基-19-去甲基-4-雄烯-3-酮，6β,10β,17β-三羟基-19-去甲基-4-雄烯-3-酮，以及多种羟基化诺龙衍生物：10β,17β-二羟基-19-去甲基-4-雄烯-3-酮，6β,17β-二羟基-19-去甲基-4-雄烯-3-酮，10β-羟基-19-去甲基-4-雄烯-3,17-二酮和16β,17β-二羟基-19-去甲基-4-雄烯-3-酮.并且，8个羟基化衍生物被证实具有较好的抗什曼虫活性，其中16β,17β-二羟基-19-去甲基-4-雄烯-3-酮活性最好，IC50值达到了(29.55±1.14) μM，具有非常高的工业生产价值.

依西美坦是一种不可逆的芳香酶抑制剂，可用于治疗乳腺癌.芳香酶可促进乳腺癌的增殖，通过对芳香酶的抑制，降低雌激素水平，能够减缓乳腺癌细胞生长.Baydoun等[12]采用真菌壳球孢菌(Macrophominaphaseolina)和真菌镰刀霉(Fusariumlini)对依西美坦(IX)进行生物转化，获得三个新型化合物11α-羟基-6-甲基烯-雄烷-1,4-二烯-3,17-二酮(X)，16β,17β-二羟基-6-甲基烯-雄烷-1,4-二烯-3-酮(XI)，17β-羟基-6-甲基烯-雄烷-1,4-二烯-3,16-二酮(XII)和一个已知化合物17β-羟基-6-甲基烯-雄烷-1,4-二烯-3-酮(XIII)，如转化反应式

其中化合物X具有较好的癌细胞抑制能力.

2羰基化反应

羰基化反应(Carbonylation)又称加氢甲酰化反应，是将羰基引入有机化合物分子的反应，虽然其在生物转化中也是非常常见的反应，但是在甾体类化合物的生物转化中却较少出现，并且在甾体类物质的生物转化过程中，羰基化反应往往伴随着羟基化反应.

甲基雄烯酮是一种抑制睾酮分泌的的合成代谢类固醇，它能够通过刺激肌肉细胞活性，发挥促进肌肉细胞生长的作用.除了构建肌肉块作用外，甲基雄烯酮还可以增加身体的钙水平帮助治疗骨质疏松症.Baydoun等[13]采用丝状真菌菜豆壳球孢(M.phaseolina)对甲基雄烯酮(XIV)进行生物转化生成5种转化产物，其中两种为羰基化产物：17β-羟基-17α-甲基雄烷-1,4-二烯-3,6-二酮(XV)，17β-羟基-17α-甲基雄烷-1,4-二烯-3,11-二酮(XVI)，如转化反应式

并且通过抗β-半乳糖苷酶活性实验发现，比起阳性药物的IC50=48.4 mM，化合物XV具有明显的抗β-半乳糖苷酶活性，IC50=60.7 mM.

美睾酮是人工合成的一种雄性类固醇，临床上主要用于治疗雄性激素合成障碍[14]，以及男性性腺功能减退引起的精子减少性不育症[15].Allouh等[16]首次利用壳球孢菌(M.phaseolina)对美睾酮进行生物转化，产生了一种新的代谢物，1α-甲基-17β-羟基-5α-雄甾-3,6-二酮.并且将这个化合物进行了多种体外活性检测实验，如抗癌、抑制α-葡萄糖苷酶、5-磷酸二酯酶和抗氧化实验，然而并没有显著的效果.

3氢化反应

氢化反应(Hydrogenation)属于还原反应的一种，是有机化合物与氢分子的反应，在生物转化研究中具有重要的价值.微生物转化中，具有羰基，或者碳碳双键结构的底物能够在微生物的作用下，发生加氢反应.微生物加氢能使酮基还原成羟基：主要是在C-3，C17和C-20三个位点上的酮基被还原；同时，甾体结构双键的氢化则通常发生在A环上的C-1，C-2和C-4，C-5以及B环上的C-5，C-6双键的还原.不同于通过生物转化完成甾体羟基化修饰，生物转化实现甾体结构加氢的研究较少，但是作为结构修饰的另一主要方式，加氢修饰同样重要.

康复龙也称羟甲烯龙，主要用于预防和对抗肾上腺皮质激素长期使用造成的肾上腺皮质功能减退.研究表明，康复龙具有明显的免疫调节和抗炎活性.Khan等[17]通过利用壳球孢菌(M.phaseolina)，黑曲霉(Aspergillusniger)，匍枝根霉(Rhizopusstolonifer)和镰刀霉(Fusariumlini)对康复龙(XVII)进行转化，产生了两种新型氢化化合物2α,17α-二羟基甲基-5α-雄甾-3β,17β-二酮(XVIII)和17α-甲基-5α-雄甾-2α,3β,17β-三酮(XIX)，两种已知化合物 17β-羟基-2α-羟基甲基-17α-甲基-5α-雄甾-3-酮(XX)和2α-羟基甲基-17α-甲基-5α-雄甾-3β-17β-二酮(XXI)，如转化反应式

这4种化合物进行了T细胞抑制率的实验，结果表明了它们具有潜在的免疫抑制及抗炎作用.

泼尼松龙是药物生产过程中一个重要的中间体，为了获得更多的泼尼松龙衍生物，Zhang等[18]采用玫瑰产色链霉菌(Streptomycesroseochromogenes)对其进行转化，最终获得了一种氢化产物20β-羟基氢化波尼松.值得一提的是，泼尼松龙的转化率高达95.1%，该微生物转化方法可应用于工业生产中.Somayyeh等[19]首次采用腐皮镰刀菌(Fusariumsolani)和赭曲霉(Aspergillusochraceus)对氢化可的松进行了微生物转化，结果表明，氢化可的松在C20位发生了加氢还原反应，产生了化合物20β-羟基波尼松.

4脱氢反应

脱氢反应(Dehydrogenation)与氢化反应相反，是减少有机物分子中的氢原子数目的过程，常见于化工过程，但在生物转化过程中也较常见.微生物对甾体脱氢反应经常发生在A环的C-1，C-2和C-4，C-5位之间，少数脱氢也可发生在羟基上，同时甾体类药物的脱氢有助于提高和改进药理活性，降低毒副作用[20].

剑麻皂素也称替可吉宁，是合成甾体激素类药物的基本原料，利用其下游产品单烯，可合成倍他米松等120多种激素类药物，剑麻皂素对环境有一定的污染，人们常常通过氧化剑麻皂素生成孕烷-3β,16β,20-三醇来减小对环境的污染.Yang等[21]研究孕烷-3β,16β,20-三醇时发现，在采用小克银汉霉菌(Cunninghamellaechinulata)对其进行生物转化过程中，出现了脱氢化和羟基化反应，获得了两种新型脱氢产物：孕烷-3-氧-14α,16β,20-三醇，孕烷-3-氧-7β,16β,20-三醇.替勃龙，是一种用于激素合成的类固醇，可用于更年期妇女激素代替物.研究表明：替勃龙及其代谢物能特异性抑制硫酸酯酶，这种硫酸酯酶可以抑制乳房癌生长.Shah等[22]通过利用粉红单端胞霉(Trichotheciumroseum)对替勃龙进行生物转化，结果发生了双键变换反应，产生了Δ4-替龙，后经脱氢反应，产生了脱氢反应产物：Δ1,4-替龙.Costa等[23]对猪脱氧胆酸进行了微生物降解途径的探究，发现球菌属(Rhodococcus)对其进行转化的过程中，含有脱氢反应.通过微生物转化，实现了C-3位羟基的脱氢，产生了产物6α-羟基-3-氧-5β-胆-22-羧酸，实现了C-1，C-2的脱氢生成了6α-羟基-3-氧-1,4-烯-22-羧酸.

醋酸可的松是一类非常重要的甾体类药物，临床上常用于肾上腺皮质功能减退症，以及合成糖皮质激素所需酶系缺陷所致的各型先天性肾上腺增生症.Zhang等[24]利用简单节杆菌(Arthrobactersimplex)，运用基因工程学手段，成功提升了节杆菌转化醋酸可的松到强的松的转化率，使转化率提升了32.9%.Preeti等[25]采用诺卡式菌属(Nocardia)对胆固醇(XXII)进行生物降解，在降解过程中，胆固醇侧链降解，生成4-雄烯-3,17-二酮(XXIII)，后经脱氢作用，产生了最终降解产物1,4-雄二烯-3,17-二酮(XXIV)，其转化反应式为

5Baeyer-Villiger氧化反应和溴化反应

甾体类化合物经过Baeyer-Villiger氧化，可在羰基旁边插入氧原子，产生相应的甾体类内酯.甾体类内酯被证明具有抗癌等多种生物活性，并且能够抑制5α-还原酶，阻断睾酮变成5α-二氢睾酮的路径，以此能够治疗雄激素依赖性疾病.甾体类睾内酯可抑制甾体芳香化酶，可用于治疗乳腺癌[26].至于溴化反应在甾体类物质的生物转化中较少出现，且主要应用于降解有害物质.

Swizdor等[27]首次采用青霉属菌(Penicilliumlanosocoeruleum)对多个C-19甾体进行微生物转化实验，包括雄甾酮，表雄甾酮，雄甾二酮和脱氢表雄酮.结果表明：经过氧化产生了3α-羟基-17α-羧基-D-环-5α-雄甾-17-酮，3β-羟基-17α-羧基-D-环-5α-雄甾-17-酮，3α-羟基-17α-羧基-D-环-5α-雄甾-17-酮，17α-羧基-D-环-5α-雄甾-3,17-二酮和1,2-二氢睾内酯.随后，Swizdor等[28]对5α-饱和甾体的生物转化研究中，报道了球孢白僵菌(Beauveriabassiana)对3α-二氢雄甾酮(XXV)的羟基化和氧化修饰.在研究中，他们首次采用球孢白僵菌(Beauveriabassiana)对3α-二氢雄甾酮进行生物转化，在进行羟基化后，还发生了氧化反应，生成了羟化氧化产物：3α,11α-二羟基-17α-羧基-D-环-5α-雄甾-17-酮(XXVI)，11α-羟基-17α-羧基-D-环-5α-雄甾-3,17-二酮(XXVII)，3β,11α-二羟基-17α-羧基-D-环-5α-雄甾-17-酮(XXVIII)，3α,7β-二羟基-17α-羧基-D-环-5α-雄甾-17-酮(XXIX)，其转化反应式为

Hanna等[29]采用淡水绿藻斜生栅列藻(Desmodesmussubspicatus)对17α-炔雌醇(XXX)进行了生物转化，超过68%的底物被绿藻所转化，生成溴化产物2,4-二溴-17α-炔雌醇(XXXI)，其转化反应式为

6结论

甾体类物质的生物转化是通过微生物对甾体类的化合物进行代谢转化，使之引入一些化学基团或者是去除一些基团，从而发生化学结构层面的变化.如今，甾体类物质的生物转化方法，已广泛应用于甾体类药物生产，具有广阔的应用价值.对于甾体类物质的生物转化所产生的转化衍生物，能为筛选更好生物活性的物质提供重要的先导化合物.目前，甾体类物质的的生物转化研究已有将近70年的历史，但是研究大多集中在甾体类物质的羟基化上，对甾体类物质的羰基化、氢化和氧化结构修饰的研究较少.随着科学技术的发展和科研的不断进步，生物转化的机理和转化酶系将会更加透彻，生物转化和化学合成组合使用的方法定将为更多物质的全合成服务，这一技术必能为甾体类物质的开发与利用发挥更加重要的作用.

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(责任编辑：刘岩)