植物组培技术常见问题及其预防措施

2016-01-20任辉丽

南方农业·下旬 2015年12期

任辉丽

摘要主要对植物组培技术中常见问题如污染、材料褐变和玻璃化现象等方面进行阐述，并在此基础上提出相应对策。

关键词植物组织培养技术；常见问题；预防措施

中图分类号：S722 文献标志码：B 文章编号：1673-890X（2015）36-0-02

植物组织培养技术作为当代生物科学中最有生命力的一门学科，应用广泛，在农业、林业、工业和医药业等行业均有涉及，且产生了巨大的经济和社会效益，但由于组培育苗操作程序复杂，各种技术难题仍受到广大科研工作者的困扰，如污染、材料褐变、瓶苗玻璃化等常见问题屡见不鲜，试验组培成功的植物多样，但利用组培规模化生产的植物并不多见，下面对该技术中常见的三大问题（污染、材料褐变和玻璃化现象）及预防措施进行阐述[1-4]。

1 污染问题

1.1 污染原因

污染是指在培养过程中，培养基或培养材料上滋生真菌、细菌等微生物，使培养材料不能正常生长和发育的现象。在实验室及规模化生产中，组织培养中污染时有发生，造成污染的原因主要有以下几点：培养基以及在培养过程中的各种器具灭菌不彻底；培养时外植体消毒不彻底；接种和培养环境不清洁；接种人员无菌操作不严格；培养容器原因，包括盖子和封口膜等。此外，材料灭菌不彻底同样也会造成成批接种材料被细菌污染，而且培养过程不严格遵守无菌操作规程也是造成细菌污染的重要原因。培养环境不清洁、超净工作台的过滤装置失效、培养容器的口径过大以及封口膜破损等主要引起真菌污染[5-9]。

1.2 污染的预防措施

1.2.1 灭菌彻底

严格各个环节的操作流程，特别是培养基及操作过程中的各种器具必须要严格灭菌。培养基灭菌有以下要求：耐高温培养基在121～123 ℃条件下灭菌20～30 min。其次，接种用的器具除了经过高温霉菌外，在接种的过程中，每使用1次后，都要蘸酒精在酒精灯火焰上灼烧灭菌，特别是在不慎接触到污染物时，极易由于器具引起污染。最后，对于被污染的培养瓶和器皿要单独浸泡，单独清洗，有条件的灭菌后再清洗[10-14]。

1.2.2 选择适当的外植体

要认真地选择外植体，减少外植体上的带菌量。一般来说，培养时，田间生长的材料带菌会比在温室生长材料多；从带菌数量多少来看：多年生木本材料多于一二年生的草本材料；老的材料多于幼嫩的材料。

茎尖外植体培养时注意的是：预培养，在室内或无菌条件下进行；冲洗，用水冲洗后插入无糖的营养液；发枝，以新抽的嫩枝作为外植体；暗培养后取材，要求在无菌条件下暗培养，从抽出的徒长黄化枝条上取材。以上措施均可明显减少污染。

1.2.3 外植体消毒

外植体上可能附着外生菌和内生菌。外生菌可以通过表面消毒方法杀灭；而内生菌生长的植物材料内部，表面消毒难以杀灭，培养一段时间后，病原菌自伤口处滋生。防治内生菌首先将欲取材的植株或枝条放在温室或无菌培养室内预培养，再在培养液中添加一些抗生素或消毒剂。

1.2.4 环境消毒

环境消毒在降低培养污染率中尤为重要，且在高温高湿的条件下污染率会显著增高，需要注意到的是，必须定期进行熏蒸或喷雾消毒。各类消毒方法因人因环境而异：高锰酸钾和甲醛熏蒸对人体有一定伤害，但是其消毒效果明显，一般每年熏蒸2～3次。日常推荐使用的紫外线照射消毒以及臭氧消毒机消毒同样可以有效降低污染率，而且对人体的伤害也不大。

1.2.5 严格无菌操作

在接种时，要严格无菌操作，避免人为因素造成污染。为了使超净工作台有效工作，防止操作区域本身帶菌，要定期对过滤器进行清洗和更换。

2 材料褐变

在植物组织培养中，由于组织中多酚氧化酶被激活，使细胞酚类物质被氧化而产生棕褐色醌类物质，从而出现了褐变这种现象。它严重地影响外植体的脱分化、再分化和生长，对培养过程的损失显而易见[15-17]。

2.1 产生机理

产生的机理分为2种：非酶促褐变和酶促褐变。在植物组织培养中，由酶促褐变引起的褐变被认为是主要根源，其中引起褐变的酶有很多种，主要是由多酚氧化酶PPO、过氧化物酶POD、苯丙氨酸解氨酶等组成。在初次培养和继代培养过程中，经过测定试管苗的褐变程度和PPO的活性，有研究表明PPO活性与褐变程度的高低具有显著的相关性。

2.2 抑制措施

在抑制褐变的方法上，目前已经有了诸多有效的处理措施，主要从以下方面来展开：去氧化；抑制特异性酶；通过有效手段控制或减少中间产物的产生。具体措施如下。

2.2.1 预处理措施

外植体材料的预处理：冲洗外植体，在2～5 ℃的低温下处理12～24 h，升汞或酒精消毒，取外植体浸泡10 min后培养（浸泡时采用0.1%漂白粉溶液）。

2.2.2 取材措施

在外植体的取材过程中需要注意以下几点：褐变程度较小的品种和部位更适宜；幼苗褐变程度低；夏季材料褐变趋向性更明显；早春和秋季的材料更合适取材。

2.2.3 培养基的质量控制

培养基的状态和类型与褐变程度具有明显的相关性，因此，更要注意对培养基的成分的质量控制，严格把关，减少污染率。

2.2.4 抑制剂和吸附剂的选择

在长期的组织培养过程中，目前已经广泛的使用了褐变抑制剂及部分吸附剂，目的是最大程度的降低褐变程度，以降低不必要的经济损失。由此，可以在培养基中加入PPO抑制剂以及部分抗氧化剂，如偏二亚硫酸钠、L-半胱氨酸、抗坏血酸等。常用的吸附剂有活性炭和聚乙烯吡咯烷酮PVP。

2.2.5 细胞筛选措施

为剔除易褐变的细胞，经常性进行细胞筛选在组织培养过程中是很有必要的一项措施，在外植体接种环节里，在接种后的1～2 d立即转移，使其再次转移到其他新鲜培养基中继续培养，降低培养物的毒害作用，经过连续转移（一般5～6次），褐变程度显著下降[18]。

3 玻璃化问题

“玻璃苗”在组织培养过程中不可避免，而且在大规模培养中玻璃化问题亟待解决。

3.1 玻璃化形成的机理

植物组织培养过程中，玻璃化现象是特有的一种生理性病变，目前有关玻璃化形成机理方面的研究主要集中在水势过高的影响，生长调节剂平衡问题和矿质元素平衡供应问题3个方面，普遍认为是培养环境中的各方面因子共同作用导致植物组织新陈代谢紊乱，进而出现“玻璃苗”。

3.2 预防措施

目前主要采取以下几方面措施来预防玻璃化的发生。

3.2.1 外植体的选择

优先考虑不易玻璃化的基因型及部位，且顶芽部位有助于减少玻璃苗的产生。

3.2.2 培养基成分的调整

第一，外源生长调节剂的添加很有必要。如添加IAA、GA3、ABA，可以减少玻璃苗的出现。第二，合理调整成分浓度。如降低铵态氮浓度的同时提高硝态氮含量，在预防玻璃苗的大规模生产实践中成效显著。第三，调整适宜琼脂浓度。由于琼脂杂质中的部分元素（如Ca2+、Mg2+等）含量会影响培养基中矿质元素的合理比例，因此一般琼脂浓度不低于0.8%，并且针对条状琼脂会提前浸泡24 h；第四，添加有机物根皮苷、添加植物生长调节剂合成前体如ACC或添加适宜浓度的活性炭等均可有效地抑制玻璃苗形成。

3.2.3 改变培养的环境条件

光照条件：尽量采取光照培养，在适宜的光照时间内适当提高光照强度。温度条件：根据不同材料将温度调整在适宜范围，一般将温度控制在24～28℃。湿度条件：为降低培养容器内的空气相对湿度，必要的通气措施尤为重要，同时要注意改善氧气供应状况，因此使用可调节通气的组培专用瓶可以达到良好的通气效果。pH值：一般条件下调整pH值于7.0左右。其他条件：继代培养每间隔4～5代，一般20 d为一个周期，培养时采用无激素的培养基，可先培养一个周期，再用1/2含量激素的培养基进行过度，过度一个周期后，再用原培养基培养。

参考文献

[1]李骏明.植物组织培养教程[M].北京：中国农业大学出版社，l996.

[2]毛秀红，荀守华，毛加发，等.植物组培快繁技术常见问题及解决对策[J].山东林业科技，2004，153（4）：45.

[3]黄海波，淡明，郭安平，等.植物组织培养中存在的主要问题与对策[J].安徽农业科学，2006（12）：2632-2633.

[4]于守超，赵兰勇，王芬，等.植物组织培养过程中外植体褐变机理研究进展[J].山东林业科技，2004，154（5）：61-63.

[5]陈凯.植物组织培养中褐变的产生机理及抑制措施[J].安徽农业科学，2004，32（5）：1034-1036.

[6]盛长忠.红豆杉愈伤组织培养中褐变现象的初谈[J].南开大学学：自然科学，2001，34（4）：120-122.

[7]豐锋.试管苗玻璃化现象的研究进展[J].北方园艺，2003（3）：71-73.

[8]陶铭.组织培养中畸形胚状体及超度含水态苗的研究[J].西北植物学报，2001，21（5）：1048.

[9]张洪胜，牟云官，辛培刚.苹果离体培养中试管苗玻璃化现象机理的探讨[J].果树科学，1991，8（2）：71-74.

[10]王艳，曾幼玲，贺宾，等.油菜试管苗玻璃化发生机理的研究初探[J].生物技术，2006，16（1）：75-77.

[11]韩美丽，唐玉贵，黄华艳.种灯白掌组培再生体系的建立与玻璃化现象的控制[J].广西林业科学，2000，29（3）：111-114.