骨髓增殖性疾病诊断综合分析的意义

周　萍，　唐吉斌，　焦瑞宝，　章　文，　曹春鸾，　崇慧峰，　钟维君

(1.铜陵市人民医院临床检验中心，安徽 铜陵 244009；2.艾迪康医学检验中心，浙江 杭州 310000)

骨髓增殖性疾病诊断综合分析的意义

周萍1，唐吉斌1，焦瑞宝1，章文1，曹春鸾1，崇慧峰1，钟维君2

(1.铜陵市人民医院临床检验中心，安徽 铜陵 244009；2.艾迪康医学检验中心，浙江 杭州 310000)

摘要：目的探讨骨髓增殖性疾病(MPD)患者JAK2基因V617F点突变情况以及与血细胞计数、骨髓细胞形态结合对诊断的意义。方法对102例外周血血细胞计数有不同程度增高的患者采用实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测JAK2基因V617F点突变，并同步进行骨髓细胞形态学观察。结果54例MPD患者中真性红细胞增多症(PV)、原发性血小板增多症(ET)、原发性骨髓纤维化(PMF)患者的JAK2基因V617F突变率分别为91.7%、50.0%、66.7%，48例非MPD患者(包括继发性红细胞增多症、继发性血小板增多症、继发性骨髓纤维化)均未检测到JAK2V617F突变；两组比较差异有统计学意义(P<0.05)。MPD组与非MPD组之间有部分血细胞计数值的差异有统计学意义(P<0.05)，MPD组骨髓细胞形态具有一定特征。结论MPD患者JAK2基因V617F点突变率明显高于继发性血液学异常，与血细胞计数及骨髓细胞形态结合对诊断有重要意义。

关键词：骨髓增殖性疾病；JAK2基因V617F点突变；骨髓细胞形态；血细胞计数

中图分类号：

文章编号：1673-8640(2015)01-0026-05R446.11

文献标志码：码：A

DOI：10.3969/j.issn.1673-8640.2015.01.007

Abstract:ObjectiveTo investigate the significance of V617F mutation in JAK2 gene combining cytometry and bone marrow cell morphology on the diagnosis of myeloproliferative disease (MPD). MethodsOf the 102 cases whose peripheral blood number increased with various degrees, the real-time fluorescence quantitation polymerase chain reaction (PCR) was applied to detect the V617F mutation in JAK2 gene, and the cell morphology of bone marrow was observed. ResultsIn the 54 cases of MPD, including polycythemia vera (PV) and essential thrombocythemia (ET) and primary myelofibrosis (PMF), the positive rates of JAK2 V617F mutation were 91.7%, 50.0% and 66.7% respectively, while JAK2 V617F mutation was not detected in the 48 non-MPD cases with statistical significance (P<0.05). Between MPD and non-MPD groups, the value of part blood cell count had statistical significance (P<0.05). There existed a certain characteristic on bone marrow cell morphology in MPD group. ConclusionsCompared with patients with secondary blood disease, MPD patients display higher frequency of V617F mutation in JAK2 gene, and there is vital significance for the diagnosis with combination of cytometry and bone marrow cell morphology.

作者简介：周萍，女，1976年生，学士，主管技师，主要从事血液学检验工作。

通讯作者：唐吉斌，联系电话：0562-2827195。

收稿日期：(2014-10-12)

Significance of comprehensive analysis on the diagnosis of myeloproliferative diseaseZHOUPing1,TANGJibin1,JIAORuibao1,ZHANGWen1,CAOChunluan1,CHONGHuifeng1,ZHONGWeijun2.(1.DepartmentofClinicalLaboratory,TonglingPeople′sHospital,AnhuiTongling244009,China; 2.ADICONClinicalLaboratories,ZhejiangHangzhou310000,China)

Key words: Myeloproliferative disease;JAK2 gene V617F mutation; Bone marrow cell morphology; Blood cell count

在2008年第4版世界卫生组织(WHO)关于髓系肿瘤分类中，将骨髓增殖性疾病(myelo-proliferative disorders，MPD)更名为骨髓增殖性肿瘤(myeloproliferative neoplasms，MPN)，仅将融合基因(BCR-ABL)阴性的真性红细胞增多症(polycythemia vera，PV)、原发性血小板增多症(essential thrombocythemia，ET)、原发性骨髓纤维化(primary myelofibrosis，PMF)列入MPD[1]，这一分型改变源自对血液系统肿瘤分子致病机制的逐步了解。2005年国际上多个研究组[2-3]的研究显示，PV、ET和PMF中普遍存在着JAK2基因V617F点突变。在临床上，MPD患者也有部分未见JAK2V617F突变，与继发性红细胞增多症、继发性血小板增多症(secondary thrombocythemia，ST)、继发性骨髓纤维化的鉴别诊断需结合外周血造血细胞数量增多程度和骨髓象形态特征等其它诊断指标，特别在症状不明显的疾病早期阶段。因此，我们就MPD相关实验室指标结合作一分析总结，为临床诊断提供一定的参考价值。

材料和方法

一、材料

1.标本来源2010年1月至2014年7月铜陵市人民医院门诊及住院病例102例，男50例，女52例，年龄9~83岁。其中PV 24例，ET 24例，PMF 6例，继发性红细胞增多症16例，ST 22例，继发性骨髓纤维化10例。所有疾病诊断参考2008年世界卫生组织(World Health Organization, WHO)[1]诊断标准。

2.标本采集所有病例抽取骨髓液(或外周血)2 mL，乙二胺四乙酸二钾(EDTA-K2)抗凝，外周血2 mL(EDTA-K2抗凝)及骨髓穿刺涂片数张。

3.主要仪器和试剂SYSMEX XT2000i 全自动血液分析仪，聚次甲基染料、氨丁三醇缓冲液、鞘液、质控品等均为原装配套试剂。美林恒通Merinton SMA1000型紫外分光光度计。ABI 7500荧光定量聚合酶链反应(PCR)仪。DNA抽提试验盒购自北京天根公司(血液/细胞/组织基因提取试剂盒)，PCR反应体系试剂使用TOYOBO公司的THUNDERBIRD qPCR Mix成品试剂盒，引物和探针由宝生物工程(大连)有限公司(TAKARA)合成。

二、方法

1.外周血采取常规血细胞计数检测，骨髓涂片经瑞氏染色，对有核细胞进行分类计数及形态学观察。

2.基因组DNA提取抽取患者骨髓或外周血2 mL，EDTA抗凝，用DNA抽提试验盒按照说明书抽提基因组DNA。用紫外分光光度计测量浓度并确定纯度后将DNA终浓度调节为50~100 ng/μL(常规提取时浓度为25~250 ng/μL，A260 nm/A280 nm为1.8~2.0)。

3.JAK2基因V617F点突变检测在NCBI上下载JAK2基因序列，针对JAK2基因第14外显子设计相关引物，正义引物1条和反义引物1条，野生型和突变型探针各1条，分别为VIC和FAM标记，使用双蒸水稀释引物和探针(储存浓度100 ng/μL，工作浓度10 ng/μL)。按试剂盒说明书要求配置20 μL PCR扩增反应体系，加入模板2 μL，混匀离心。采用实时荧光PCR检测JAK2基因V617F突变。反应条件：95 ℃ 预变性1 min，95 ℃ 10 s，60 ℃ 1 min，共45个循环，在60 ℃ 1 min采集荧光信号，阳性对照使用阳性质粒，空白对照使用双蒸水， 扩增后直接使用荧光PCR分析软件分析检测结果。

三、统计学方法

结果

一、JAK2基因荧光PCR扩增曲线

JAK2基因扩增曲线见图1，其中阳性结果见图2、阴性结果见图3。

图1　JAK2基因荧光PCR扩增曲线

图2　JAK2基因V617F突变阳性曲线

图3　JAK2基因V617F突变阴性曲线

二、MPD组和非MPD组JAK2基因V617F点突变情况及突变阳性率比较

MPD组PV、ET、PMF中JAK2基因V617F点突变率分别为91.7%、50.0%、66.6%，非MPD组继发性红细胞增多症、ST、继发性骨髓纤维化均未检测到JAK2基因V617F点突变，见表1。MPD组与非MPD组JAK2基因V617F突变阳性率差异有统计学意义(χ2=53.833，P<0.05)，见表2。

表1　各组JAK2基因V617F点突变情况

三、各组间血细胞计数比较

PV组白细胞(white blood cell, WBC)、血红蛋白(hemoglobin, Hb)、血小板(platelet, PLT)均高于继发性红细胞增多症组(P<0.05)，见表3。ET组PLT高于继发性血小板增多症组(P<0.05)，而WBC和Hb差异无统计学意义(P>0.05)，见表4。PMF组与继发性骨髓纤维化组之间血细胞计数值差异无统计学意义(P>0.05)，见表5。

表2　MPD组与非MPD组JAK2基因V617F点突变

表3PV组与继发性红细胞增多症组血细胞计数比较

组别例数WBC(×109/L)Hb(g/L)PLT(×109/L)PV组2415.03±5.14178.90±14.13526.50±206.90继发性红细胞增多症组169.68±5.20158.25±19.15182.75±97.18

表4ET组与继发性血小板增多症组血细胞计数比较

组别例数WBC(×109/L)Hb(g/L)PLT(×109/L)ET组2410.27±4.29122.38±19.21757.58±254.92继发性血小板增多症组228.66±3.22112.27±15.43496.64±175.66

表5　PMF组与继发性骨髓纤维化组血细胞计数比较　[M(P25，P75)]

讨论

MPD多有不同程度的脾大和静脉血栓形成的临床表现，外周血出现一系或多系的血细胞数量增多，存在高发的JAK2基因V617F点突变。这种突变与造血生长因子受体的活化及信号传导密切相关。JAK2基因V617F点突变能使红细胞生成素受体、粒细胞集落刺激因子受体、血小板生成素受体等异常活化，使信号经过由Janus激酶和信号传导与转录激活因子组成的信号传导途径(JAK-STAT途径)传导时效应增强，促使红系祖细胞异常增生以及粒系祖细胞、巨核细胞系过度增生[4-5]。发生突变的干/祖细胞进一步分化，在骨髓中粒、红、巨三系有核细胞中可以有不同程度的表达，在外周血中的成熟粒细胞上也有表达。由于存在少量突变克隆株的情况以及不同方法的敏感性差异的情况，实时荧光定量法检测出JAK2基因V617F点突变的每个样本的突变比例大致为10%~100%。梁国威等[6]报道TaqMan探针结合较低变性温度下复合扩增聚合酶链反应的检测下限为0.1%，敏感性高于常规的DNA直接测序法。高敏感的方法可以提高阳性检出率，特别对于少量突变克隆株的检测，但需要注意的是过于敏感的方法有可能会导致假阳性的结果。

MPD需要与其它继发血细胞增多性疾病鉴别。本研究中，PV组与继发性红细胞增多症组之间WBC、Hb、PLT差异均有统计学意义(P<0.05)，PV组骨髓象可见骨髓有核细胞增生明显活跃，特别以红系增生为显著，粒系和巨核系也有不同程度的增生，与外周血细胞增多情况相符。而继发性红细胞增多症骨髓象多无明显异常增生的表现，与其红细胞生成素(erythropoietin,EPO)增多和红细胞代偿性增生的致病原因相符。PV组JAK2基因V617F突变率达91.7%，明显高于继发性红细胞增多症组，与文献报道[5]相近。在疾病早期外周血细胞数升高不明显时，JAK2基因V617F突变和血清EPO水平检测结合骨髓象有助于诊断。ET组PLT明显高于继发性血小板增多症组(P<0.05)，JAK2基因V617F突变率有50.0%，而ST组未见突变。对于未检出突变的ET，结合骨髓象中巨核系形态特点有诊断意义。ET组表现为巨核细胞胞体较大，成熟明显，PLT分布也明显增多，常可见体积小或巨大、畸形PLT；而ST组多表现为PLT分布略增多，巨核细胞无明显异常形态。李伟皓等[7]报道MPD患者的PLT、PLT压积、PLT体积分布宽度高于ST患者，PLT平均体积低于ST患者，这与MPD的巨核细胞克隆性增殖本质相关。两类疾病PLT参数的变化情况也与本研究中ET组和ST组不同的PLT形态表现相符合。PMF组JAK2基因V617F突变率达到66.7%，但血细胞计数值与继发性骨髓纤维化组比较差异无统计学意义(P>0.05)。PMF组骨髓象可见粒系和巨核系增生较活跃、红系增生较低，血涂片中泪滴状红细胞易见；而由慢性粒细胞白血病、骨髓转移癌等原发病后期引发的继发性骨髓纤维化骨髓象可见有明显特征的白血病细胞或癌细胞。两组间主要依靠骨髓和外周血细胞的形态特征结合JAK2基因V617F突变检测来鉴别诊断。本研究MPD患者中有一系增高或二系增高的PV患者，JAK2基因V617F突变率较高的情况与叶选馨等[8]报道一致。但与该报道不同的是，本研究的MPD患者中有2例女性PV患者红细胞和PLT数均见增高。因此，在MPD的JAK2基因V617F突变率与外周血增高程度相关性的方面需要进一步的大样本的研究。

YHIM等[9]和BAKOSI等[10]研究发现，在JAK2基因V617F点突变与临床表现和血液学特征的关系上，ET和PMF患者中JAK2基因V617F突变者PLT、WBC数量高于未突变者，脾大更明显，发生静脉血栓几率也较大，并且对羟基脲更敏感，而对非氯米喹酮则不敏感。对于突变阳性者，可选择JAK2抑制剂的靶向治疗。因此，JAK2基因V617F点突变检测结合骨髓细胞形态以及血细胞数值综合分析有助于MPD的诊断，为治疗提供依据。

参考文献

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[9]YHIM HY, KIM HS, SOHN JY, et al. JAK2 V617F-positive essential thrombocythemia in a patient with Klinefelter syndrome：a case report[J]．Cancer Genet Cytogenet，2010，198(2)：162-165．

[10]BAROSI G，ROSTI V．Novel strategies for patients with chronic myeloproliferative disorders[J]．Curr Opin Hematol, 2009，16(2)：129-134．

(本文编辑：范基农)