3种不同方法检测艰难梭菌芽孢率的比较

徐　蓉,　葛　平,　陈　蓉,　刘学杰

(上海市临床检验中心，上海 200126)

3种不同方法检测艰难梭菌芽孢率的比较

徐蓉,葛平,陈蓉,刘学杰

(上海市临床检验中心，上海 200126)

摘要：目的了解艰难梭菌检测的芽孢率并进行比较。方法采用平板涂布法、相差显微镜计数法和孔雀绿染色法3种检测方法对艰难梭菌ATCC 43596和VPI 10463经培养96 h和120 h 后的芽孢率进行了比较分析。结果显示平板涂布法芽孢检出率最高为(25.3%、15.6%)，变异较大(SD=7.1%，4.3%)；相差显微镜计数法和孔雀绿染色法结果相近分别为(13.3%、9.4%)、(13.4%、9.8%)，变异较小(SD=1.9%、0.8%)、(SD=1.4%、0.9%)。结论在选用平板涂布法检测芽孢率时，建议联合相差显微镜法或者孔雀绿染色法以减少偏移。

关键词：芽孢；艰难梭菌；检测

中图分类号：

文章编号：1673-8640(2015)02-0201-03R446.5

文献标志码：码：A

DOI：10.3969/j.issn.1673-8640.2015.02.023

作者简介：徐蓉，女，1973年生，本科，主要从事微生物检验工作。

收稿日期：(2014-12-25)

艰难梭菌(Clostridiumdifficile)为革兰阳性厌氧芽孢杆菌，是医院感染的主要病原菌之一，约25%～33%的抗菌药物相关性腹泻以及90%的伪膜性肠炎都是由艰难梭菌所致[1]。芽孢是艰难梭菌传播的主要形式，具有感染性，耐热、耐干燥，对许多消毒剂和抗菌药物高度耐药。因此，芽孢在宿主体外的有氧环境中可长期存在，体内则可能与艰难梭菌感染治疗停药后复发相关[2]。

文献报道的艰难梭菌产芽孢率有较大差异，其原因可能与菌株之间的差异和样本量的大小有关，亦可能与研究者们所用方法不同相关[3-5]。本实验对平板涂布法、相差显微镜计数法和孔雀绿染色后计数法检测艰难梭菌产芽孢率进行了比较分析。

材料和方法

一、材料

1. 实验菌株采用国际标准菌株艰难梭菌ATCC 43596和VPI 10463。

2. 培养基和试剂Brucella琼脂和厌氧发生袋为美国BBL Microbiology Systems公司产品；血红素(5 mg/L)，维生素K1(5 mg/L)与牛磺胆酸钠盐为美国Sigma公司产品；脱纤维羊血为上海闵行区诸翟无菌动物血试剂供应站产品。0.01 M磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline, PBS)为德国Merck公司产品。

二、方法

1. 厌氧菌培养冰冻菌株在布氏血平板上复苏并传代2次(37 ℃厌氧培养48 h)，再次传代，将平板上过夜培养的艰难梭菌用PBS制成麦氏0.5的菌悬液，取10 μL菌悬液分别涂布于布氏血平板上，37 ℃厌氧培养96 h和120 h。

2. 平板涂布法将平板上菌落全部刮入PBS悬液，将该菌悬液等量分装成2管，一管直接用生理盐水10倍系列稀释，取0.1 mL菌液均匀涂布在添加牛磺胆酸盐的布氏血平板，菌落计数(a：营养细胞和芽孢)；另一管65 ℃水浴20 min以杀死营养细胞，再用生理盐水进行系列稀释，取0.1 mL均匀涂布相同平板，厌氧培养48 h后菌落计数(b：芽孢)。产芽孢率=b/a×100%。

3. 相差显微镜计数法挑一个纯菌落入4.5 mL PBS缓冲液混匀(或直接从菌液中取样，必要时1∶10稀释成合适浓度)，取7 μL加入Burker载玻片。置于相差显微镜下，菌液流动静止后观察。任取Burker载玻片上3个大区，共48个小区即48个视野进行计数。取10 μL加入产芽孢率 =芽孢数/(芽孢数+营养细胞数)×100%。

4. 孔雀绿染色后显微镜计数法将培养96 h的艰难梭菌作涂片、干燥、固定；然后滴加3～5滴孔雀绿染液于已固定的涂片上，并用木夹夹住载玻片在火焰上加热，使染液冒蒸汽但勿沸腾或蒸干，加热时间从染液冒蒸汽时开始计算约4~5 min；倾去染液，待玻片冷却后水洗至孔雀绿不再褪色为止；用番红水溶液复染1 min，水洗；待干燥后，置油镜观察，芽孢呈绿色，菌体呈红色。观察10个视野的营养细菌与芽孢数。产芽孢率 =芽孢数/(芽孢数+营养细胞数)×100%。

5. 重复性实验2株标准菌株艰难梭菌ATCC 43596和VPI 10463分别在96 h和120 h培养后检测芽孢率，同样条件重复实验3次。

三、统计学方法

采用Excel 2007计算百分比进行数据统计分析。

结果

一、3种不同方法检测艰难梭菌芽孢率结果比较

ATCC 43596、VIP 10463培养96 h，用平板涂布法检测芽孢率最高(平均检出率为25.3%、15.6%)，培养120 h(平均检出率为43.0%、35.4%)，但变异较大；相差显微镜计数法(平均检出率为13.3%、9.4%)，培养120 h(平均检出率为35.0%、27.8%)和孔雀绿染色法(平均检出率为13.4%、9.8%)，培养120 h(平均检出率为32.7%、28.2%)结果相近且变异较小，结果见表1。

表1　3种不同方法对培养96 h、120 h艰难梭菌芽孢检测率的比较　(%)

讨论

平板涂布法是最为常用的检测芽孢率的方法。该方法原理为在65 ℃水浴20 min或100%乙醇共同孵育后，营养细胞被杀死，仅芽孢能存活。经过上述处理后在平板上生长的克隆数量就可代表芽孢数量。但是，虽然经过水浴或者乙醇处理，仍有可能少部分对热/化学抗性强的营养细胞遗留下来，也可能有少许芽孢并没有转化为营养细胞。因此，在研究不同菌株芽孢率的时候需考虑细菌生长情况，芽孢抗性以及芽孢的萌发能力。因此，用平板计数法时建议使用营养条件好的培养基，在艰难梭菌芽孢率检测时可在培养基中加用含有促芽孢萌发的牛磺胆酸盐[6]。

芽孢与营养细胞相比化学组成存在较大差异，容易在相差显微镜下观察，但对技术人员的经验要求非常高。因为观察的是在PBS悬液中的活细胞，所以首先必须速度快，否则液体干掉后就不能再进行观察；其次因为是活细胞，在液体中会以不同面显示，粗看可能是营养细胞，但翻个面其实有芽孢，因此，技术人员的经验非常重要。

孔雀绿染色法也是观察芽孢常用的方法。其原理为芽孢壁厚、透性低，着色、脱色均较困难。因此，用着色力强的染色剂(如孔雀石绿)在加热条件下进行染色时，染料不仅可以进入菌体，而且也可以进入芽孢，进入菌体的染料可经水洗脱色，而进入芽孢的染色的染料则难以透出，若再用复染液(如沙黄水溶液)染色后，芽孢仍然保留初染剂的颜色，而菌体被染成复染剂的颜色，即菌体和芽孢分别染成红色和绿色易于区分。但缺点也很明显，芽孢壁厚染色困难，所以有时会有染色失败[7]。而且孔雀绿染色只能检测芽孢率，不能计数营养细胞或芽孢的数量。

3种检测艰难梭菌芽胞方法都有明显的优缺点。其中平板涂布法结果变异较大，相差显微镜法和孔雀绿染色法结果差异相对较小且较为接近。因此，建议在做艰难梭菌的芽孢率研究时至少同时采用2种方法以减少结果的偏移。今后应考虑研发新的检测方法或者对现有方法进行改进，使得结果更为稳定可靠、且简便易操作。

参考文献

[1]FREEMAN J, BAUER MP, BAINES SD, et al. The changing epidemiology of Clostridium difficile infections[J]. Clin Microbiol Rev,2010,23:529-549.

[2]孙静,陈建华.枯草芽孢杆菌形成芽孢时母细胞中基因表达的调控[J].生物技术，2007，17:79-83.

[3]MERRIGAN M, VENUGOPA A, MALLOZZI M, et al. Human Hypervirulent Clostridium difficile Strains Exhibit Increased Sporulation as Well as Robust Toxin Production[J]. J Bacteriol, 2010,192:4904-4911.

[4]VOHRA P, POXTON I. Comparison of toxin and spore production in clinically relevant strains of Clostridium difficile[J]. Microbiology, 2011,157：1343-1353.

[5]BURNS DA, HEAP JT, MINTON NP. The diverse sporulation characteristics of Clostridium difficile clinical isolates are not associated with type[J]. Anaerobe,2010,16:618-622.

[6]SORG JA, SONENSHEIN AL. Inhibiting the initiation of Clostridium difficile spore germination using analogs of chenodeoxycholic acid, a bile acid[J]. J Bacteriol, 2010,192：4983-4990.

[7]宋淑贤，聂清.微生物学常用细菌染色方法的改进[J].黑龙江医药科学，2001，24：36.

(本文编辑：储怡星)