不同细菌感染致脓毒症患者血小板减少差异原因分析

晏　峰，　任振焕，　周　颖

(丽水市人民医院检验科，浙江丽水 323000)

不同细菌感染致脓毒症患者血小板减少差异原因分析

晏峰，任振焕，周颖

(丽水市人民医院检验科，浙江丽水 323000)

摘要：目的初步分析细菌感染致脓毒症患者血小板(PLT)减少原因，并研究区分革兰阳性(G+)细菌与革兰阴性(G-)细菌生化特征，为临床早期预防多器官衰竭，降低死亡率提供依据。方法检测155例脓毒症患者组、56例非脓毒血症患者(感染组)和43例非感染对照组的血小板计数、降钙素原(PCT)、C-反应蛋白(CRP)、白细胞(WBC)、中性粒细胞(NE)百分比及Bcl-xL蛋白水平，对上述3组患者的6项指标进行统计学分析。同时进行血细菌培养，将75例血培养阳性的脓毒症患者分为G+组和G-组，检测分析2组间PLT、PCT结果、Bcl-xL蛋白水平及在不同PCT截值的百分比。结果脓毒症患者组生化指标与对照组相比差异均有统计学意义(P<0.01)；与感染组比较， PLT、PCT、CRP和Bcl-xL水平差异均有统计学意义(P<0.01),WBC和中性粒细胞百分比差异均无统计学意义(P>0.05)；感染组患者PCT、CRP、WBC、中性粒细胞百分比与对照组相比，差异均有统计学意义(P<0.01)，但PLT和Bcl-xL差异均无统计学意义(P>0.05)。同时发现，G+细菌与G-细菌脓毒症患者在PCT<2.0 ng/mL时，百分率差异无统计学意义(P>0.05);2.0 ng/mL≤PCT≤10.0 ng/mL时，G+组患者的百分率明显高于G-组(P<0.01)；而在PCT≥10.0 ng/mL时，G-组患者百分率明显高于G+组(P<0.01)。G-细菌性脓毒症组PLT、PCT水平均低于G+细菌性脓毒症组(P<0.01)。结论脓毒症患者出现PLT减少、PCT升高与细菌作用于Bcl-xL启动PLT凋亡程序有关；G-细菌致脓毒症较G+细菌更易启动PLT凋亡，具有更高危险性。

关键词：脓毒症；血小板减少；Bcl-xL蛋白

中图分类号：

文章编号：1673-8640(2015)02-0137-04R446.11

文献标志码：码：A

Abstract:ObjectiveTo analyze primarily the difference causes of thrombocytopenia by different bacterial infections in patients with sepsis, to distinguish the biochemical characteristics of Gram-positive bacteria (G+) and Gram-negative bacteria (G-), and to provide the reference for the clinical early prevention of multiple organ failure and reduce the mortality rate. MethodsA total of 155 sepsis patients, 56 patients with non-sepsis (infection group) and 43 non-infected controls were enrolled, and their platelet (PLT), procalcitonin (PCT), C reactive protein (CRP), white blood cell (WBC), the percentage of neutrophils (NE) and Bcl-xL protein levels were determined. The results were analyzed statistically. Blood culture was performed simultaneously, 75 cases of blood culture-positive sepsis patients were classified into G+and G-groups. Their PLT, PCT, Bcl-xL protein and different PCT cross-section percentages were analyzed. ResultsBiochemical parameters of sepsis group had obvious difference with those of control group (P<0.01). Compared with infection group, serum PLT, PCT, CRP and Bcl-xL protein levels were significantly different (P<0.01), and WBC and the percentage of NE had no statistical significance (P> 0.05). In infection group, PCT, CRP, WBC, NE percentage had statistical significance compared with those in control group (P<0.01), but the differences of PLT and Bcl-xL protein were not significant (P> 0.05). For G+and G-groups in sepsis patients, when PCT <2.0 ng/mL, there was no statistical significance (P>0.05). When 2.0 ng/mL≤PCT≤10.0 ng/mL, the percentage in G+group was significantly higher than that in G-group (P<0.01). When PCT ≥ 10.0 ng/mL, the percentage in G-group was significantly higher than that in G+group (P<0.01). PLT and PCT levels in G-group were lower than those in G+group (P<0.01). ConclusionsThe reduction of PLT and the increase of PCT are related to the apoptosis of PLT caused by Bcl-xL protein. G-sepsis is easier to start PLT apoptosis than G+sepsis with higher risk.

作者简介：晏峰，男，1975年生，硕士，副主任技师，主要从事临床生化检验工作。

DOI[12]CHARLES PE, LARE S, AHO S, et al. Serum procalcitonin elevation in critically ill patients at the onset of bacteremia caused by either Gram negative or Gram positive bacteria[J]. BMC Infect Dis, 2008,8:38. 10.3969/j.issn.1673-8640.2015.02.008

收稿日期：(2014-05-26)

Difference cause analysis on thrombocytopenia by different bacterial infections in patients with sepsisYANFeng,RENZhenhuan,ZHOUYing.(DepartmentofClinicalLaboratory,LishuiCityPeople′sHospital,ZhejiangLishui323000,China)

Key words: Sepsis; Thrombocytopenia; Bcl-xL protein

脓毒症是目前医学界的棘手难题，已成为重症监护病房(ICU)危重病患者主要死因之一[1]，对感染病原体的早期识别及合理应用抗菌药物可明显减少细菌耐药，改善预后、降低病死率[2]。研究发现，血小板(PLT)对细菌毒素十分敏感，35%～59%的脓毒症患者可发生PLT减少[3]，PLT减少症是死亡危险标志[4]。我们分析细菌感染致脓毒症患者PLT减少原因，并研究区分革兰阳性(G+)细菌与革兰阴性(G-)细菌致脓毒症表观特征，为临床早期预防多器官衰竭，降低死亡率提供依据。

材料和方法

一、临床资料

选取2012年5月至2012年12月，丽水市人民医院重症病区收治的危重患者共211例，其中男137例，女74例，平均年龄(71.86±14.78)岁，14～91岁。据2001年美国危重病学会制定的脓毒症临床治疗指南的诊断标准[5]，将患者分为2组：脓毒症组155例，非脓毒症组(感染组)56例，感染组经实验室或影像学检查，结合临床表现诊断存在感染灶(如尿液、粪便常规提示感染，胸片、胸CT呈炎性渗出表现，局部引流液为脓性，外周血、导管、分泌物、痰、中段尿、粪便等标本培养阳性等)。另选取非感染对照组43例，无任何感染指征的患者，观察期间未应用抗菌药物，病情平稳。155例脓毒症患者中血培养阳性75例，均为单一菌株，其中G+细菌30例，G-细菌45株，血培养标本的采集及培养均由专人严格按《全国临床检验操作规程(第3版)》执行，排除整个过程中细菌污染的可能。

二、排除标准

(1)既往有肝素引起的PLT减少症者；(2)有凝血障碍相关的出血倾向患者(PLT<30×109/L)；(3)急性细菌性心内膜炎患者；(4)孕产妇；(5)存在活动性出血者；(6)严重脑外伤、脑出血者。

三、检测方法和仪器

空腹采集患者标本，测血常规、血清降钙素原(PCT)与Bcl-xL蛋白水平，进行血培养。血清PCT测定采用免疫层析法，由武汉明德生物科技公司提供仪器及配套试剂，灵敏度0.1 ng/mL。PLT采用BECKMAN COULTER LH 750自动血液分析仪检测。血培养采用梅里埃BacT/ALERT3D全自动血培养仪，并在Phoenix 100自动细菌鉴定仪进行细菌鉴定及药敏试验。Bcl-xL蛋白检测采用BD流式细胞仪检测。

四、统计学方法

结果

一、脓毒症组、感染组与非感染对照组生化指标比较

脓毒症患者组生化指标与对照组相比差异均有统计学意义(P<0.01)；与感染组比较，PLT、PCT、C反应蛋白(CRP)和Bcl-xL水平差异均有统计学意义(P<0.01),白细胞(WBC)和中性粒细胞百分比差异均无统计学意义(P>0.05)；感染组患者PCT、CRP、WBC计数、中性粒细胞百分比与对照组相比差异均有统计学意义(P<0.01)，但PLT和Bcl-xL差异均无统计学意义(P>0.05)，结果见表1。

表1脓毒症组与感染组PCT、PLT、CRP、WBC计数、中性粒细胞百分比比较

组别例数PLT(×109/L)PCT(ng/mL)CRP(mg/L)WBC(×109/L)NE(%)Bcl-xL(ng/mL)脓毒症组15571±86#*14.5±26.90#*105.1±66.2#*12.7±5.6#0.865±0.095#8.6±6.3#感染组56155±730.59±0.34#39.4±55.0#11.8±5.0#0.882±0.050#21.8±9.5对照组43176±950.12±0.264.2±6.87.8±6.40.602±0.10525.2±10.6

注：与感染组比较， *P<0.01；与对照组比较，#P<0.01

二、脓毒症组PLT与其它表观指标相关性分析比较

脓毒症患者PLT与其它作为感染及脓毒症有关表观指标中相比，除Bcl-xL外均呈负相关关系，与Bcl-xL正相关性最强，PCT负相关性最强见表2。因此，选择PCT与Bcl-xL作为细菌性脓毒症相关的最表观指标。

表2　脓毒症患者PLT与PCT、CRP、WBC、NE

注:*P<0.01

三、G-细菌及G+细菌脓毒症组患者PCT水平各截值百分率(%)比较

按德国重症学会脓毒症诊断指导方针，将PCT水平分为<0.5 ng/mL、0.5 ng/mL≤PCT<2.0 ng/mL、2.0 ng/mL≤PCT≤10.0 ng/mL、≥10.0 ng/mL。据此定量标准划分，G+细菌与G-细菌脓毒症患者在PCT<2.0 ng/mL时，百分率差异无统计学意义(P>0.05);2.0 ng/mL≤PCT≤10.0 ng/mL时，G+细菌组患者的百分率明显高于G-细菌组(P<0.01)；而在PCT≥10.0 ng/mL时，G-细菌组患者百分率明显高于G+细菌组(P<0.01)，见表3。

四、G-细菌及G+细菌脓毒症PLT与PCT、Bcl-xL水平分析

G-细菌性脓毒症组PLT、PCT、Bcl-xL水平与G+细菌脓毒症组比较，差异均有统计学意义(P<0.01)，见表4。

表3　G-细菌脓毒症与G+细菌脓毒症间PCT不同截值阳性率比较　[例(%)]

表4　G-细菌脓毒症与G+细菌脓毒症PLT、PCT与Bcl-xL结果比较

注：与G+细菌脓毒症组比较，*P<0.01

讨论

危重患者PLT与生存率呈负相关，而感染是PLT减少症的独立危险因素[6-7]，PLT减少症则为预测死亡率一个强有力的指标[8]。研究表明，脓毒症是一种由感染引起的全身性炎症反应，本质是在原发病基础上，微生物引起的感染状态所引发的、炎性介质呈梯级、瀑布样放大释放，并易导致凝血系统高度激活，出现PLT消耗过多或凋亡，影响患者生存的行为[9]。而用于脓毒症早期诊断和治疗监测的PCT临床应用价值突出[10]，本研究结果亦证实：在与脓毒症患者PLT计数呈负相关的表观指标中，PCT相关性最强，因为选取此二者关系作为细菌感染致脓毒症PLT减少的最直接指标进行分析。

本研究发现，G-细菌与G+细菌感染致脓毒症PCT升高严重程度有差异(P<0.01)。PCT水平在2.0～10.0 ng/mL时，以G+细菌感染为主(73.4%与20.0%)；而在PCT≥10.0 ng/mL时，G-细菌组患者的百分率明显高于G+细菌组(75.6%与23.3%)，说明G-细菌感染脓毒症患者在PCT水平升高程度上要高于G+细菌感染致脓毒症患者。估其为G+细菌和G-细菌诱导机体发生炎症反应时信号通路不同,释放不同炎性介质，从而导致血清PCT水平升高程度不同[8]。G-细菌的重要成分脂多糖(LPS)和多种细胞因子[肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-6、IL-2，IL-18]等均可以刺激、诱导PCT的产生和释放，但与其它细胞因子相比，当患者为G-细菌感染时，LPS可能直接促进PCT mRNA的表达和蛋白翻译[11]，有研究显示，LPS在无细胞因子情况下在体外能直接诱导人培养细胞产生高水平PCT，而G+细菌细胞壁成分无此作用[12]，感染患者仅受细胞因子诱导和刺激，其PCT水平升高不如G-细菌组患者明显，这与本研究结果一致。

脓毒症组较一般感染组相比，PLT下降明显(P<0.01)，推测在脓毒症状态下，机体PLT内在凋亡机制启动，导致降解加快。有学者等[13]研究发现，产α-溶血素(HlyA)类细菌，如G-大肠杆菌性或金黄色葡萄球菌性败血症患者致病菌能诱导患者PLT中Bcl-xL蛋白降解。Bcl-xL蛋白为PLT关键性生存蛋白，调节PLT黏附和/或聚集，功能缺失或浓度降低易引起PLT快速和激烈退化，促进凋亡。本研究结果证实，脓毒症患者产HlyA类细菌触发降解PLT Bcl-xL蛋白程序，Bcl-xL水平降低，促使PLT生存质量改变，功能及数量下降明显。COX等[14]研究认为，HlyA虽是一个107 000蛋白质，但会引起红细胞溶血及多种细胞凋亡结果相一致，推测其先诱发形成PLT孔隙，激活PLT内蛋白酶活性，触发Bcl-xL蛋白降解钙离子通道开放，促进凋亡[15]。HlyA类G-细菌重要成分LPS虽不能增加Bcl-xL蛋白表达，但证明能诱导PLT中细胞内钙瞬变，激活PLT内蛋白酶，促进Bcl-xL降解，引起PLT凋亡。同时，本研究通过对G-细菌性脓毒症和G+细菌性脓毒症Bcl-xL浓度及PLT比较发现，即G-细菌较G+细菌更易启动PLT凋亡。

本研究结果证明，不同细菌能激活PLT凋亡通路，激活程度与脏器功能损害程度有关,表现为PCT升高越明显，PLT、Bcl-xL表达越低，脏器损害越严重。研究提示了如何区分不同细菌感染所致PCT活性及Bcl-xL表达指标为临床早期预防多器官衰竭，降低死亡率提供依据。

参考文献

[1]FRY DE. Sepsis， systemic inflammatory response, and multiple organ dysfunction: the mystery continues[J]. Am surg, 2012,78(1):1-8.

[2]谭萍, 张松, 邹汉良,等. 临床细菌耐药分析及耐药酶的检测[J]. 实用预防医学, 2007,14(6):1729-1731．

[3]LEVI M, LÖWENBERG EC. Thrombocytopenia in critically ill patients[J] .Semin Thromb Hemost, 2008, 34(5):417-424.

[4]姜伟玲， 李天瑯. 血小板联合APACHEⅡ评分在危重病临床监测中的意义[J]. 中华急诊医学杂志, 2005,14(8):684-685.

[5]LEVY MM, FINK MP, MARSHU LC, et al. 2001 SCCM/ESICM/AC/CP ATS/SIS international sepsis definitions conference[J]. Crit Care Med, 2003,31(4):1250-1256.

[6]VANDIJCK DM, BLOT SI, DE WAELE JJ, et al. Thrombocytopenia and outcome in critically ill patients with bloodstream infection[J]. Heart Lung, 2010,39(1):21-26.

[7]王兵, 韩鹦赢, 李红洁,等. 危重患者血小板减少症发病危险因素及预后分析[J]. 中国急救医学, 2008,28(12):1072-1076.

[8]张逸，陈景连，叶宇钊. 降钙素原在感染性疾病中的临床研究进展[J]. 临床和实验医学杂志, 2012,11(8):635-636.

[9]BOZZA FA, SHAH AM, WEYRICH AS, et al. Amicus or adversary: platelets in lung biology,acute injury, and inflammation[J]. Am J Respir Cell Mol Biol, 2009, 40(2):123-134.

[10]石岩,刘大为. 降钙素原在全身性感染中的研究进展[J]. 中华内科杂志, 2011,50(5):444-446.

[11]OBERHOFFER M, STONAUNS I, RUSSWURM S, et al. Procalcitonin expression in human peripheral blood mononuclear cells and its modulation by lipopolysaccharides and sepsis-related cytokines in vitro[J]. J Lab Clin Med,1999,134(1):49-55．

[13]KRAEMER BF, CAMPBELL RA, SCHWERTZ H, et al. Bacteria differentially induce degradation of Bcl-xL, a survival protein,by human platelets[J]. Blood, 2012,120(25): 5014-5020.

[14]COX D, KERRIGAN SW, WATSON SP. Platelets and the innate immune system: mechanisms of bacterial-induced platelet activation[J]. J Thromb Haemost, 2011, 9(6):1097-1107.

[15]DHAKAL BK, MULVEY MA. The UPEC pore-forming toxin α-hemolysin triggers proteolysis of host proteins to disrupt cell adhesion, inflammatory,and survival pathways[J]. Cell Host Microbe, 2012, 11(1):58-69.

(本文编辑：范基农)