婴幼儿血管瘤源性血管内皮细胞系XPTS-1中p-Akt及Bcl-xL的表达及意义

陆宇，刘硕硕(泰州市第二人民医院，江苏泰州225599)

婴幼儿血管瘤源性血管内皮细胞系XPTS-1中p-Akt及Bcl-xL的表达及意义

陆宇，刘硕硕
(泰州市第二人民医院，江苏泰州225599)

摘要:目的观察活化的蛋白激酶B(p-Akt)及B细胞淋巴瘤/白血病-x基因长片段(Bcl-xL)在婴幼儿血管瘤源性血管内皮细胞系(HemEC)XPTS-1中的表达变化并探讨其意义。方法取处于对数生长期的XPTS-1细胞，经特异性PI3K/Akt信号通路抑制剂LY294002处理的XPTS-1作为实验组，未经处理的XPTS-1作为对照组，采用流式细胞仪检测两组细胞周期分布和凋亡率，应用Western blotting法检测p-Akt和Bcl-xL在各组中的表达。结果

实验组G0/G1期细胞比例明显增加(P＜0.01)，S期和G2/M期细胞明显减少(P＜0.05);实验组细胞凋亡率高于对照组(P＜0.01);实验组p-Akt和Bcl-xL表达均比对照组明显降低(P均＜0.01)。结论p-Akt及Bcl-xL在婴幼儿血管瘤细胞中的表达明显降低，二者可能在XPTS-1细胞凋亡中发挥重要作用。

关键词:血管瘤;磷脂酰肌醇3激酶;磷酸化丝/苏氨酸激酶; B细胞淋巴瘤/白血病-x基因长片段doi: 10.3969/j.issn.1002-266X.2015.33.009

婴幼儿血管瘤(IH)是婴幼儿较常见的良性肿瘤，根据血管瘤内皮细胞的生物学特点及临床表现，血管瘤的病程可分为增生期、消退期和消退完成期［1，2］，关于其增生、消退的机制目前尚未阐明。磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)通路是细胞内重要的信号转导通路，在诸多生物过程中发挥作用，包括细胞凋亡、新陈代谢、细胞的生长及增殖［3］，有研究［4］证实PI3K/Akt信号通路参与血管生成。LY294002是PI3K/Akt通路的特异性抑制剂，通过特异性抑制PIK3 p110亚单位的催化活性，可阻止PI3K的磷酸化过程，进而阻止通路的激活。B细胞淋巴瘤/白血病-x基因长片段(Bcl-xL)是公

认的抗凋亡蛋白，在恶性肿瘤中研究较多，血管瘤中研究较少，有文献［5，6］报道，Bcl-xL可能参与血管形成。本研究中，我们通过阻断PI3K/Akt信号通路后检测婴幼儿血管瘤源性血管内皮细胞系XPTS-1［7］细胞周期分布和凋亡率的变化及活化的Akt(p-Akt)、Bcl-xL表达，初步探讨p-Akt及Bcl-xL蛋白在婴幼儿血管瘤中的表达及意义。

1　材料与方法

1.1主要材料及试剂胎牛血清购于杭州四季青生物工程材料有限公司，DMEM培养基和RPMI1640培养基购于美国GIBCO公司，胰蛋白酶购于华美生物工程有限公司，DMSO购于天津永大化学试剂开发中心，LY294002购于美国Sigma公司，兔抗人p-Akt多克隆抗体购于美国NEOMARKERS公司，兔抗人Bcl-xL多克隆抗体购于美国NEOMARKERS公司，流式细胞仪试剂盒购于北京四正柏生物科技有限公司。

1.2婴幼儿血管瘤内皮细胞的培养、鉴定及分组采用组织块加酶消化法培养血管瘤内皮细胞。去除新鲜血管瘤标本上残留的皮肤和脂肪组织，将瘤体剪成1～2 cm3的组织块，0.25%胰蛋白酶37℃消化10～20min，将消化后的组织块修剪成1mm3大小，接种于无菌培养瓶内，加入3mL含20%胎牛血清、70 μg/L VEGF、100mg/L肝素的DMEM培养基，37℃、5% CO2培养箱中孵育，4～5d后更换培养液。待组织块周围爬出内皮细胞较多时去除组织块，更换培养液后继续培养。细胞铺满瓶底后1∶2传代培养。传至16代时，换用RPMI1640培养基，继续培养，建立婴幼儿血管瘤XPTS-1细胞系［7］。细胞鉴定采用免疫组化法对Ⅷ因子相关抗原进行检测。结果显示血管瘤内皮细胞Ⅷ因子表达阳性。取处于对数生长期的XPTS-1细胞，分为实验组、对照组。

1.3细胞周期检测取培养的已传代并贴壁的细胞，先用血清饥饿24 h，使细胞生长周期同步化;对照组XPTS-1细胞常规培养，实验组参照文献［8］加入50 μmol/L LY294002处理，继续培养24 h，收集细胞，PBS洗2次，加入碘化丙啶(PI)，避光，4℃作用30min，用流式细胞仪检测细胞周期。

1.4细胞凋亡率测算将LY294002处理24 h后的2组细胞，调整细胞浓度为1×106/mL，分别取1mL，PBS洗涤2次，弃上清，加入预冷的结合缓冲液100 μL重悬细胞，加入AnnexinV-FITC 5 μL和PI(20g/L)10 μL，混匀后于室温避光孵育15min，在反应管中加入400 μL结合缓冲液，流式细胞仪分析细胞凋亡情况。

1.5 p-Akt和Bcl-xL表达检测将LY294002处理24 h后的两组细胞吸出培养液，PBS洗涤后每孔加入细胞裂解液50 μL提取总蛋白。以牛血清蛋白做标准品，测蛋白浓度。取50 μg总蛋白经10%聚丙烯酞胺凝胶电泳分离后，转至硝酸纤维素膜上，5%脱脂牛奶(含0.1% Tween20)封闭1 h，加一抗(p-Akt 1∶1 000; Bcl-xL 1∶1 000)，室温孵育过夜，洗膜，加辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育2 h，洗膜，ECL显色，暗室中曝光，显影，定影，保存胶片，扫描分析p-Akt和Bcl-xL表达情况。

1.6统计学方法采用SPSS13.0统计软件。计量资料以珋x±s表示，组间比较用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1两组细胞周期分布比较G0/G1期细胞比例明显增加(P＜0.01)，S期和G2/M期细胞明显减少(P＜0.05)，细胞生长被阻滞于G0/G1期，见表1。

表1　两组处理24 h后XPTS-1细胞周期分布(%，)

表1　两组处理24 h后XPTS-1细胞周期分布(%，)

注:与对照组比较，△P＜0.05，*P＜0.01。

组别　各期细胞比例G0/G1期　S期　G2/M期实验组78.63±5.26　19.51±2.82　1.60±0.74对照组　61.89±3.28*　32.75±2.17*　5.07±1.19△

2.2两组细胞凋亡率比较对照组和实验组的细胞凋亡率分别为(0.27±0.14)%、(34.72± 0.51)%，两组比较，P＜0.01。

2.3两组p-Akt和Bcl-xL表达比较对照组和实验组中p-Akt的表达强度分别为0.97±0.22、0.21 ±0.07，Bcl-xL的表达强度分别为0.59±0.11、0.12 ±0.03，实验组与对照组两种蛋白表达强度差异均有统计学意义(P均＜0.01)。

3　讨论

IH是婴儿期常见的良性肿瘤，其特点为异常血管的迅速增长。直至目前其增生和退化的细胞及分子机制尚未完全阐明。目前IH的治疗方法主要有口服或局部注射糖皮质激素、放疗、激光［9］、口服α-干扰素、硬化剂局部注射［10］及手术等，但均有不同程度不良反应，寻求新的治疗方法成为目前研究的热点。

Akt又名蛋白激酶B，是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，位于PI3K/Akt信号传导通路的中心环节，Akt的活化依赖PI3K对磷脂酰肌醇环上3位羟基的特异磷酸化，p-Akt通过磷酸化下游的靶蛋白发挥促进细胞增殖、抑制细胞凋亡、化疗耐受等作用［11］。

p-Akt能调节细胞周期G1/S时相转换，其机制是通过使失活，增加cyclin-D1转录，磷酸化p21、p27等实现［12］。本实验结果发现，阻断PI3K/Akt信号通路后G0/G1期细胞比例比对照组明显增加，p-Akt表达明显降低，表明通路阻断后，活化的Akt减少，调节细胞G1/S期的作用不能发挥，细胞被阻滞于G0/G1期。

Bcl-2家族在细胞凋亡过程中发挥重要的调控作用，其成员包括抗凋亡因子和促凋亡因子，调节多细胞机体的发展及组织的动态平衡［13］。Bcl-x是Bcl-2家族的成员，是1993年Boise等［14］以鼠Bcl-2 的cDNA为探针从鸡淋巴细胞cDNA文库中筛选到的一个克隆，激活后有双重调节作用，因其mRNA的第一个外显子5'端剪接位点不同而存在两种大小不同的片段，即表达长片段的Bcl-xL及短片段的Bcl-xS，Bcl-xL在细胞质中通过与Bax形成异源二聚体抑制细胞凋亡。近年来，Bcl-xL在肿瘤发生发展中的作用受到较多关注，如前列腺癌［15］、肺癌［16］等。本研究结果发现，阻断PI3K/Akt信号通路后，XPTS-1细胞的凋亡率明显增加，p-Akt和Bcl-xL表达均降低。表明PI3K/Akt信号通路与IH细胞的增生、凋亡可能存在某种关系，且抗凋亡因子Bcl-xL亦在其中发挥重要作用。根据国内外研究结果提示，p-Akt可能是通过磷酸化NF-κB，激活其转录功能，促进Bcl-xL表达［17］，一旦p-Akt的活性被抑制，Bcl-xL表达亦会下降，从而其抗凋亡作用受到抑制。

综上所述，PI3K/Akt信号通路及其下游的BclxL在婴幼儿血管瘤细胞的凋亡中发挥重要作用，据此推测婴幼儿血管瘤的增生、消退很可能与PI3K/ Akt通路的激活与抑制及Bcl-xL的表达高低有关系。本研究为以PI3K/Akt信号通路为靶点的治疗方法提供了实验依据，亦为今后婴幼儿血管瘤增生、消退机制更进一步的研究提供了新思路，但细胞内的信号转导通路错综复杂，涉及因子很多，婴幼儿血管瘤的发病机制仍需更深入地研究去完善。

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收稿日期:( 2015-04-10)

文章编号:1002-266X(2015)33-0027-03

文献标志码:A

中图分类号:R732.2