沙棘叶总黄酮含量测定方法的建立

2016-01-19李淑珍陈月林

西北师范大学学报（自然科学版） 2015年6期

关键词：分光光度法总黄酮正交试验

李淑珍,武　飞,陈月林,杨　颖

(1.乌兰察布医学高等专科学校,内蒙古乌兰察布　012000;

2.乌兰察布中心医院,内蒙古乌兰察布　012000)

沙棘叶总黄酮含量测定方法的建立

李淑珍1,武飞2,陈月林1,杨颖1

(1.乌兰察布医学高等专科学校,内蒙古乌兰察布012000;

2.乌兰察布中心医院,内蒙古乌兰察布012000)

摘要：本研究通过比色条件NaNO2,Al(NO3)3和NaOH的加入量和静置时间单因子筛选、多因子正交试验和方法学考察，建立了NaNO2-Al(NO3)3-NaOH体系分光光度法测定沙棘叶总黄酮含量的优化方法.结果得出测定沙棘叶总黄酮含量的步骤是：取1 mL样液于烧杯中，加70%的乙醇1 mL，再加入5%的亚硝酸钠溶液0.5 mL，摇匀，静置6 min；再加入10%的硝酸铝溶液0.5 mL，摇匀，静置6 min；然后加入4%的氢氧化钠溶液6 mL，摇匀，放置15 min后，以70%乙醇作参比溶液，于波长510 nm 处测定吸光值.测得沙棘总黄酮含量为2.049%，比优化前提高1.337倍，均达到《中国药典》规定的标准.该法稳定性和重现性好,精密度和回收率高，并且设备简单、操作便捷，可为其他材料总黄酮的测定提供参考.

关键词：沙棘叶；总黄酮；含量测定；分光光度法；正交试验

收稿日期：2015-05-14;修改稿收到日期:2015-08-05

E-mail:448609108@qq.com

基金项目:内蒙古自治区教育厅高等学校科学技术研究项目(NJZC14407)

作者简介：李淑珍(1974—)，女，内蒙古乌兰察布人，副教授，硕士.主要研究方向为天然产物研究与开发.

中图分类号：Q 949.9

文献标志码：标志码：A

文章编号：章编号：1001-988Ⅹ(2015)06-0094-04

Abstract:A method for determination of total flavonoids in Hippophe rhamnoids L leaves is established,by singlefactor screening,multiple-factor orthogonal test and methodology examination of NaNO2-Al(NO3)3-NaOH system spectrophotometry.The single factor includs reaction volume and reaction time.The results show that the optimization methods are:Take 1 mL sample solution in the beaker,add 70% ethanol 1 mL and 5% NaNO20.5 mL,shake well,react 6 min.Then add 10% Al(NO3)30.5 mL,shake well,react 6 min;After that add 4% NaOH 6 mL,shake well,react 15 min,determine absorbance at 510 nm with 70% ethanol as reference solution.The methodology shows that the method has good stability and reproducibility,high precision and recovery.It is more suitable for the determination content of total flavonoids in Hippophe rhamnoids L leaves， which has simple equipment,convenient operation and high accurate.using this method,the content of total flavonoids is 2.049%,which is 1.337 times than before optimized.Both of then reach to the regulation standard of “China pharmacopoeia”.This method can be looked as a reference method for the determination of total flavonoids in other materials.

Establishment of determination method

of total flavonoids inHippopherhamnoidsL leaves

LI Shu-zhen1,WU Fei2,CHEN Yue-lin1,YANG Ying1

(1.Wulanchabu Medical College,Wulanchabu 012000,Inner Mongolia,China;

2.Wulanchabu Central Hospital,Wulanchabu 012000,Inner Mongolia,China)

Key words:HippopherhamnoidsL leaves;total flavonoids;content determination;spectrophotometry;orthogonal test

沙棘(HippopherhamnoidsL)属胡颓子科沙棘属植物，又名醋柳(汉名)，是一种落叶灌木或小乔木，资源丰富，我国就有200万km2，占世界总面积的90%以上[1].沙棘根系发达，需水量少，成林快，而且抗寒抗旱、耐盐碱、耐瘠薄，生态适应性广，是防风固沙、保持水土的优选物种.沙棘为药食同源植物，其根、茎、叶、花、果、种子含有丰富的营养物质和生物活性成分，具有健脾消食、止咳祛痰、活血散瘀生理功效及显著的药用功能[2-5]，被国际营养学家和医药学家誉为21世纪人类最具发展前途的营养保健及医药植物，被广泛应用于食品、医药、化妆品等多个领域[6].

沙棘总黄酮的定量测定方法报道有HPLC法和分光光度法等.HPLC法测定总黄酮含量精确度高、误差小，但需预先知道总黄酮中的单体成分以此为对照进行测量，检测成本较高.在实际生产和科研中多用分光光度法，常采用在碱性介质中加铝盐显色，此法设备简单、操作简便、检测成本低，同时也不需要预先知道总黄酮中的单体成分[7].但NaNO2-Al(NO3)3-NaOH体系分光光度法操作方法文献报道不一致[8-12]，NaNO2和Al(NO3)3静置时间有2,4,6,8 min不等，NaOH静置时间有10,15,20 min 不等；NaNO2和Al(NO3)3加入量有0.3,0.4,0.5,0.7,1 mL不等，NaOH加入量有1,2,4,6,10 mL 不等.本试验对芦丁标准溶液和沙棘叶样品溶液中总黄酮含量进行分析比较，建立NaNO2-Al(NO3)3-NaOH 体系测定沙棘叶总黄酮含量的优化方法.

1材料与方法

1.1仪器与试剂

722可见分光光度计(上海精密科学仪器有限公司)；芦丁标准品(批号：100080-201408，中国药品生物制品检定所)；沙棘叶采于内蒙古乌兰察布市卓资县郊野，经杨鸿飞教授鉴定；其他试剂均为分析纯.

1.2标准溶液的制备

准确称取在120 ℃干燥至恒量的芦丁标准品10 mg，置50 mL 量瓶中，加70%乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得浓度为0.2 mg·mL-1的芦丁溶液.精密量取10 mL用70%的乙醇定容50 mL，得芦丁标准溶液(40 μg·mL-1).

1.3样品溶液的制备

称取7月份沙棘叶10 g，加入150 mL 50%乙醇70 ℃水浴加热提取0.5 h，过滤，回收乙醇，定容为100 mL，从中取5 mL定容到50 mL的容量瓶中，得样品溶液.

1.4最大吸收波长的确定

取芦丁标准溶液、样品溶液各1 mL，分别加70%乙醇1 mL，加入5%的NaNO2溶液0.3 mL，摇匀，放置6 min；加入10%的Al(NO3)3溶液0.3 mL，摇匀，放置6 min；再加入4%的NaOH溶液2 mL，摇匀，放置10 min 后，以70%乙醇作参比溶液[13]，于400～700 nm 处测定，结果对照品与样品溶液在510 nm 处均有最大吸收峰.

2结果与分析

2.1比色条件优化

2.1.1试剂加入后静置时间选择准确吸取标准溶液和样品溶液各1 mL，分别加70%乙醇1 mL，按表1设计，每次只改变一个时间因素，其余按1.4项所述定量方法，在510 nm测定吸光值，结果如表1.

表1　静置时间对吸光值的影响

从表1可以看出，加入NaNO2溶液后的静置时间对吸光值有一定影响.标准溶液在4～6 min 吸光值较稳定；样品溶液静置4～8 min 吸光值较稳定.综合二者，静置4～6 min即可使反应充分，吸光值基本保持不变，所以操作应在4～6 min内完成.

加入Al(NO3)3溶液后，二者都在6 min后吸光值趋于稳定，说明二者与Al3+络合反应至少需要6 min才能完成.所以加入Al(NO3)3溶液静置6 min 后，再加入氢氧化钠溶液，所测吸光值较准确、可靠.

加入NaOH溶液后静置时间对标准溶液无影响，10 min已达到稳定；样品溶液需15 min后达到稳定.说明对于组分单一的标准溶液，加入NaOH溶液10 min后吸光值已达到稳定，较长时间的放置，其吸光值稳定不变.但对于组分复杂的样品溶液其吸光值在15～20 min 达到稳定，之后又发生衰减.综合二者考虑，可选择加入NaOH溶液后放置显色15～20 min 测定吸光值[8,14].

2.1.2试剂加入量选择准确吸取标准溶液和样品溶液各1 mL，加70%乙醇1 mL，按表2设计，每次只改变一个剂量因素，其余按1.4项所述定量方法，在510 nm测定吸光值，结果如表2.

表2　溶液体积对吸光值的影响

吸光值测定结果看出，随着加入NaNO2、Al(NO3)3和NaOH溶液的量增加吸光值降低，这是由于溶液的总体积增大造成的，降低与体积增加正好成反比，说明加入量不影响吸光值.为了节约试剂，我们选择溶液的加入量都为最小值[8,14].

2.1.3多因子正交试验准确吸取样品溶液1 mL，加70%乙醇1 mL，按照L9(33)正交表设计，依次对试剂静置时间和加入量进行正交试验，测定吸光度值.静置时间优化结果见表3和表4，加入量优化结果见表5和表6.

试剂静置时间正交试验结果如表3、表4，从极差R值可以看出B>C>A，即各因素对沙棘叶总黄酮含量影响顺序为Al(NO3)3静置时间>NaOH静置时间>NaNO2静置时间.方差分析结果表明，试剂静置时间均极显著影响沙棘总黄酮含量测定(P<0.01)，故最佳条件为A3B1C2，即静置优化后结果是：加NaNO2溶液后静置6 min；加Al(NO3)3溶液后静置6 min；加NaOH 溶液静置15 min，再测定吸光值.

表3　试剂静置时间正交试验结果

表4　试剂静置时间的正交试验方差分析

注：F0.05(2,2)=19,F0.01(2,2)=99.

试剂加入量正交试验结果如表5-6，从极差R值可以看出B>A>C，即各因素对沙棘叶总黄酮含量影响顺序为Al(NO3)3加入量>NaNO2加入量>NaOH加入量.方差分析结果表明，NaNO2,Al(NO3)3和NaOH加入量均极显著影响沙棘总黄酮含量测定(P<0.01)，故最佳条件选为A1B1C3.

结合静置时间和加入量结果，NaNO2-Al(NO3)3-NaOH体系分光光度法测定沙棘叶总黄酮含量优化后的比色条件为：准确吸取样品溶液1 mL，加70%乙醇1 mL，加入5% NaNO2溶液0.5 mL，摇匀，静置6 min；加入10% Al(NO3)3溶液0.5 mL，摇匀，静置6 min；最后加入4% NaOH 溶液6 mL，静置15 min，测定吸光度.

表5　试剂加入量正交试验结果

表6　试剂加入量正交试验方差分析

F0.05(2,2)=19,F0.01(2,2)=99

2.2沙棘叶总黄酮含量测定

准确称取在120 ℃干燥至恒量的芦丁标准品10 mg，置50 mL 量瓶中，加70%乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得浓度为0.2 mg·mL-1的芦丁标准溶液.分别精密吸取芦丁标准溶液10,15,20,25,30,35,40,45 mL用70%的乙醇定容至50 mL，即为40,60,80,100,120,140,160,180 μg·mL-1的芦丁溶液，各取1 mL 于试管中，按照上述确定比色条件，于波长510 nm 处测定吸光值.以吸光值值(A)为横坐标，芦丁对照品浓度(C)为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程：Y=477.38X-2.261(R=0.9979)，结果表明芦丁在0～120 μg·mL-1浓度范围内呈良好线性关系.采用上述优化后的比色条件测定样品溶液吸光值，计算总黄酮含量(表7).

表7　沙棘叶总黄酮含量

由表7可以看出，优化前总黄酮含量为1.533%，优化后总黄酮含量达2.049%，提高1.337倍.不管是优化前还是优化后，沙棘叶总黄酮含量均符合《中华人民共和国药典》(2010版)规定,总黄酮含量以芦丁计不少于1.5%[5].

2.3方法学考察

精密吸取芦丁标准溶液和样品溶液各1 mL，分别加70%乙醇1 mL，按上述优化后比色条件，测定吸光值，连续3 次，计算RSD.精密度测试RSD为1.03%，该方法的精密度良好.重现性测试RSD为4.37%，说明该方法的重现性较好.精密吸取样品溶液1 mL，加入0.04 mg·mL-1芦丁标准溶液0.5 mL，加70%乙醇1 mL，按上述优化后的比色条件，测定吸光值，连续3 次.回收率为1.003%，该方法回收率高.

3讨论

NaNO2-Al(NO3)3-NaOH 体系分光光度法测定总黄酮的反应原理是：先用亚硝酸钠还原黄酮，再加硝酸铝络合，后用氢氧化钠溶液使黄酮类化合物开环，生成2′-OH查尔酮而显色.它的显色反应发生在黄酮类化合物的3-OH,4-OH或5-OH,4 羰基或邻二酚羟基，与铝盐进行络合反应，在碱性条件下生成红色的络合物而显色[15].在NaNO2的强碱性溶液中，其在510 nm处吸光值值最大，从而为分光光度法测定提供了可靠的依据.本实验以芦丁为对照品，采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH 体

系分光光度法，对试剂加入量和静置时间进行优化.优化后的比色方法是：取1 mL 于样液烧杯中，加70%的乙醇1 mL，再加入5%的亚硝酸钠溶液0.5 mL，摇匀，静置6 min；再加入10%的硝酸铝溶液0.5 mL，摇匀，静置6 min；再加入4%的氢氧化钠溶液6 mL，摇匀，静置15 min 后，以70%乙醇作参比溶液，于波长510 nm 处测定吸光值.该方法所用试剂比优化前增加了，所用时间增加5 min，但反应更加充分，该法测定沙棘总黄酮含量高(总黄酮含量为2.049%)，比优化前提高1.337倍，达到《中国药典》规定的标准.方法学考察显示该法重现性好(RSD为4.37%)、精密度高(RSD为1.03%)、回收率高(回收率为1.003%)，且操作简单方便，可进一步推广应用到其他药物总黄酮的测定.

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