尿儿茶酚胺LC-MS/MS检测方法的建立

2016-01-18彭颖斐陈方俊秦嘉倩潘柏申

检验医学 2015年5期

彭颖斐，　吴　炯，　郭　玮，　陈方俊，　秦嘉倩，　徐　雯，　潘柏申

彭颖斐，吴炯，郭玮，陈方俊，秦嘉倩，徐雯，潘柏申

(复旦大学附属中山医院检验科，上海 200032)

摘要：目的建立尿液儿茶酚胺[包括肾上腺素(E)、去甲肾上腺素(NE)和多巴胺(DA)]的液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)检测方法。方法以E-d3、NE-d6和DA-d4盐酸盐为内标，采用WATERS ACQUITY UPLC®HSS T3色谱柱(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)进行分离。流动相A1为2 ‰甲酸水溶液，流动相B1为甲醇(纯度为99.9%)，流速为0.5 mL/min，按A1∶B1=95∶5等度洗脱。采用电喷雾(ESI)正离子模式进行质谱分析。对方法的线性、准确度(回收率)、不精密度及最低检出限等进行性能验证。选取表面健康人群65名，建立E、NE和DA的参考区间。结果采用建立的LC-MS/MS检测尿液E、NE和DA，保留时间分别为0.58、0.89和0.63 min，检测范围为0.50～800.00 ng/mL。E、NE和DA的加标平均回收率分别为97.95%、97.78%和101.03%，最低检出限分别为0.25、2.50和2.50 ng/mL。E、NE和DA的参考区间分别为5.4～25.8、 28.5～73.1和269.1～420.5 μg/24 h。结论建立的LC-MS/MS方法能同时检测尿液中的E、NE和DA，可为嗜铬细胞瘤的诊断提供可靠的信息。

关键词：肾上腺素；去甲肾上腺素；多巴胺；尿液；液相色谱-串联质谱

Establishment of a LC-MS/MS for the determination of urinary catecholaminesPENGYingfei，WUJiong，GUOWei，CHENFangjun，QINJiaqian，XUWen，PANBaishen

.(DepartmentofClinicalLaboratory，ZhongshanHospital，FudanUniversity，Shanghai200032，China)

Abstract:ObjectiveTo establish a liquid chromatography-tandem mass spectrometry(LC-MS/MS) for the determination of urinary catecholamines， including epinephrine(E)， norepinephrine(NE) and dopamine(DA). MethodsE， NE and DA were separated by WATERS ACQUITY UPLC®HSS T3 (2.1 mm×100 mm，1.8 μm column) using E-d3， NE-d6 and DA-d4 as internal standards. The mobile phase consisted of 2‰ formic acid aqueous solution (A1) and methyl alcohol (B1, purity=99.9%). The flow rate of 0.50 mL/min was applied to the chromatographic column. Flow starting was performed with A1∶B1=95∶5. Electrospray ionization (ESI) was operated in positive ion mode. The LC-MS/MS was used， with linearity， accuracy (recovery rate)， imprecision and lower limit of determination being evaluated. A total of 65 healthy subjects were enrolled, and the reference ranges for E, NE and DA were established. ResultsThe retention times of E， NE and DA were 0.58， 0.89， 0.63 min， respectively. The determination range was from 0.50 ng/mL to 800.00 ng/mL. The mean recovery ranges were 97.95%， deter mination range 97.78% and 101.03%. The lower limits of determination for E， NE and DA were 0.25， 2.50 and 2.50 ng/mL. The reference ranges were 5.4-25.8 μg/24 h for E， 28.5-73.1 μg/24 h for NE and 269.1-420.5 μg/24 h for DA. ConclusionsThe LC-MS/MS for the simultaneous determination of E, NE and DA has been established and is suitable for clinical application. It can provide reliable information for the diagnosis of phaeochromocytoma.

Key words:Epinephrine； Norepinephrine； Dopamine： Urine； Liquid chromatography-tandem mass spectrometry

尿液儿茶酚胺[包括肾上腺素(epinephrine，E)、去甲肾上腺素(norepinephrine，NE)和多巴胺(dopamine，DA)]的检测结果对于嗜铬细胞瘤和副神经节瘤这类分泌儿茶酚胺的肿瘤的诊断具有重要意义。尽管现在许多研究推荐检测血液中甲氧基肾上腺素和去甲甲氧基肾上腺素，但尿液儿茶酚胺类物质的检测仍然应用普遍。由于儿茶酚胺类物质都是微量存在的(一般为ng/mL级)，且极易受到样本氧化的干扰，因此对儿茶酚胺类物质的精确定量就需要一个灵敏度和特异性都很好的方法。目前儿茶酚胺类物质多用高效液相色谱(high performance liquid chromatography，HPLC)电化学法检测，但存在标本前处理时间长、检测时间长、存在共洗脱复合物干扰等问题[1-3]。

随着分析技术的不断进步，液相色谱-串联质谱(liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS)走进了临床化学的检测领域，它具有检测时间短、样本用量小、灵敏度和特异性均高的优点。我们旨在建立检测尿液E、NE和DA的LC-MS/MS方法，以替代现有的HPLC方法，并对自建的LC-MS/MS的可靠性进行验证。

材料和方法

一、材料

1. 仪器Waters®XevoTMTQ MS ACQUITY UPLC®LC-MS/MS检测系统。WATER SACQUITY UPLC®HSS T3色谱柱(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)，柱温30℃。Labconco 低温真空离心浓缩仪。

2. 试剂标准品E盐酸盐、NE盐酸盐和DA盐酸盐购自美国Sigma公司；内标品E-d3、NE-d6和DA-d4盐酸盐购自美国Medicalisotopes公司；甲醇购自德国Merck公司；甲酸购自美国Roe Scientific公司。试验用水由Milli Q纯水仪制备。所有试验用化学品和溶剂均为色谱级。

3. 耗材Waters Oasis弱阳离子交换96孔固相抽提(solid-phase extraction， SPE)板和提取物收集板。

4. 对象选取2013年9月到2014年7月复旦大学附属中山医院表面健康人群65名，男32名，女33名，年龄25～63岁。

二、方法

1. 工作液制备和质控品标准品E盐酸盐、NE盐酸盐和DA盐酸盐的工作液采用0.1 mol/L盐酸溶液配制，浓度范围为0.2～800.0 ng/mL，-20℃储存。空白尿液为常规尿液在碱性条件下100℃煮沸，再调节pH值至4.0。生化尿液质控品购自伯乐公司。

2. 样本收集收集24 h尿液，防腐剂为6 mmol/L盐酸，-20℃冻存。

3. 样本前处理分别将尿液、标准品、内标品取出平衡至室温。(1)患者样本：取患者尿液480 μL，加入内标20 μL，混匀，10 000×g离心1 min；(2)标准品：取空白尿液460 μL，加入标准品20 μL，再加入内标20 μL，混匀，10 000×g离心1 min。尿液样本和标准品使用Waters Oasis弱阳离子交换96孔SPE板进行抽提和萃取。每孔预先使用甲醇(纯度99.9%)和水各200 μL进行润洗，之后加入混合有内标的500 μL样本(尿液或标准品)进行抽提和萃取，之后加入水和甲醇(纯度99.9%)各200 μL，分别将亲水、亲有机相以及不同极性的杂质洗脱，最后使用2次50 μL 2%甲酸乙腈溶液进行洗脱，将目标分析物以及同位素内标洗脱入样本收集管。将收集的样本放入低温真空离心浓缩仪冻干，检测时用100 μL水复融。

4. 色谱条件流动相A1为2 ‰甲酸水溶液，流动相B1为甲醇(纯度99.9%)；流速为0.5 mL/min。按A1∶B1=95%∶5%等度洗脱。

5. 质谱分析将萃取得到的样品上机检测，每次进样量为20 μL。离子化模式为电喷雾(electrospray ionization，ESI)正离子模式。质谱仪设置参数见表2。

表1　质谱检测参数设置

三、方法学验证

参照《化学药物临床药代动力学研究技术指导原则》[4]对自建的LC-MS/MS进行基本分析性能验证。

1. 不精密度和准确度分析所用的低浓度(E：10.1～20.3 ng/mL；NE：33.0～55.0 ng/mL；DA：48.2～81.9 ng/mL)和高浓度(E：65.9～101.0 ng/mL；NE：161.0～247.0 ng/mL；DA：394.0～654.0 ng/mL)质控品为伯乐尿液生化质控品。(1)批内不精密度：批内不精密度和准确度需要通过对质控样品重复5次分析后方可评估，不精密度可由变异系数(coefficient of variation，CV)评价，可通过检测出的浓度数值计算得到，不精密度(%)=标准偏差÷平均检测浓度×100。准确度是基于计算平均测定浓度和标示浓度的百分比偏差而评价的。偏差(%)=(平均检测浓度-标示浓度)÷标示浓度×100。偏差必须落在±15% (检测下限为±20%)之内，不精密度必须≤15%(定量下限≤20%)方能达到检测要求。(2)批间不精密度：批间不精密度和准确度的评价需要连续3 d对质控样品重复5次分析，得到3条独立的标准曲线。各浓度水平的质控品与批内不精密度的设定相同。偏差必须落在±15% (检测下限为±20%)之内，不精密度必须≤15%(定量下限≤20%)方能达到检测要求。

2. 定量下限定量下限(lower limit of quantitation，LLOQ)是指由特定的分析步骤能够精确且准确检测出的最低浓度。定量下限的有效偏差为±20%以内，且CV需≤20%。

3. 相对回收率在同一尿液标本中分别加入浓度为2、40和200 ng/mL的E、NE、DA。按样本前处理方法操作，测定加入前、后尿液E、NE、DA浓度。相对回收率为E、NE、DA增加浓度与加入浓度的比值。提取回收率在80%～120%之间判断为可接受。

4. 线性评估和标准曲线的建立选取7个浓度的标准品，每个浓度分装6份，连续检测6 d。

四、参考区间建立

检测65名表面健康人群的尿液E、NE和DA浓度，取双侧95百分位数值作为参考区间上、下限，建立参考区间。

五、统计学分析

采用SPSS 17.0 软件进行统计分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

结果

一、分离条件优化

1. 流动相中有机溶剂对保留时间的影响按照流动相A1和B1的不同比例，对标准工作溶液进行分析，结果发现被测物和内标的保留时间随着甲醇比例的增加而缩短，但变化程序逐渐减小，当甲醇比例为95%时，保留时间较短且彼此能较好分离。故确定流动相为2‰甲酸水溶液∶甲醇=95%∶5%。

2. 柱温对保留时间的影响将标准工作溶液在不同柱温下分析，随着柱温的增加，保留时间相应缩短，当柱温为30℃时，E、NE、DA能较好的分离，且分析时间适中。故确定柱温为30℃。

二、检测尿液E、NE和DA的LC-MS/MS的建立及性能验证

1. LC-MS/MS检测E、NE和DA的色谱图E(m/z 184.0→166.0)及其内标物E-d3(m/z 187.0→169.0)的保留时间均为0.63 min；NE(m/z 152.0→107.0)及其内标物NE-d6(m/z 158.0→111.0)的保留时间分别为0.58和0.57 min；DA(m/z 154.0→137.0)及其内标物DA-d4(m/z 158.0→141.0)的保留时间分别为0.89和0.88 min。见图1。

2. 线性评估和标准曲线的建立LC-MS/MS检测E、NE、DA在0.50～800.00 ng/mL内均呈线性，线性评估相关系数(r2)均>0.99，见表3。

3. 准确度E的回收率为93.1%～102.1%，平均为97.95%；NE的回收率为92.2%～104.4%，平均为97.78%；DA的回收率为96.2%～105.4%，平均为101.03%。均符合回收率80%～120%的标准。

注：(a)E(m/z 184.0→166.0)；(b)E-d3(m/z 187.0→169.0)；保留时间均为0.63 min

图1E及其内标E-d3的色谱图

注：(a)NE(m/z 152.0→107.0)，保留时间为0.58 min；(b)NE-d6(m/z 158.0→111.0)，保留时间为0.57 min

图2NE及其内标NE-d6的色谱图

注：(a)DA(m/z 154.0→137.0)，保留时间为0.89 min；(b)DA-d4(m/z 158.0→141.0)，保留时间为0.88 min

图3DA及其内标DA-d4的色谱图

4. 不精密度LC-MS/MS检测E、NE和DA不精密度(CV)均<15%，满足要求。见表3。

5. LLOQLC-MS/MS检测E、NE和DA的LLOQ[信噪比(signal-noise ratio, S/N)=10∶1]分别为0.25、2.50和2.50 ng/mL。CV分别为13.24%、10.14%、9.26%，偏差分别为18.5%、15.4%、16.5%。

表2　LC-MS/MS检测E、NE和DA的线性评估(ng/mL)

表3　LC-MS/MS检测E、NE和DA的不精密度

三、参考区间的建立

采用LC-MS/MS检测65名健康体检者尿液E、NE和DA。由于3项指标的检测结果均呈正态分布，因此取双侧95百分位数值作为参考区间上、下限。E的参考区间为5.4～25.8 μg/24 h、NE的参考区间为28.5～73.1 μg/24 h，DA的参考区间为269.1～420.5 μg/24 h。

讨论

尿液儿茶酚胺检测是诊断嗜铬细胞瘤的一项重要生化指标。在过去的许多年里，许多报道证明HPLC和免疫分析等方法检测尿儿茶酚胺代谢产物能够提高嗜铬细胞瘤诊断的灵敏度和特异性。目前常用的检测方法有荧光法、放射酶学测定法、放射免疫测定法和HPLC。前3种方法因试剂价格昂贵、步骤繁琐，因而增加了检验难度，且准确性较差；HPLC虽然测定较为准确，但仍存在标本流动相配置复杂，检测时间长，最低定量下限较高等问题[1，5]。

BICKER等[5]对液相色谱法检测各种类型标本中儿茶酚胺及其代谢产物的优缺点进行了总结。采用LC-MS/MS检测尿儿茶酚胺与HPLC进行比较，可以得出以下优点：(1)检测时间缩短：HPLC单个样本的检测时间一般为10 min左右[6]，而LC-MS/MS 在1 min内即可完成检测；(2)所需样本量少：HPLC检测所需样本量一般为1 mL左右，甚至更多，而LC-MS/MS仅需460 μL即可完成检测；(3)灵敏度高：HPLC检测E的最低检出限一般为1 ng/mL以上[5]，而LC-MS/MS由于使用配对离子对检测物质结构本身，所以检测的敏感性和特异性有所提高，本研究自建方法的最低检出限为0.25 ng/mL，较HPLC有了很大的提高。

本研究还初步建立了健康人尿液E、NE和DA的参考区间，结果分别为5.4～25.8、28.5～73.1和269.1～420.5 μg/24 h。DE JONG等[1]使用了与本研究相同的仪器和检测模式，得出的参考区间为E：15～104 nmol/24 h(2.75～19.00 μg/24 h)；NE：139～592 nmol/24 h(23.5～100.0 μg/24 h)；DA：702～2 803 nmol/24 h(107.4～428.8 μg/24 h)。该结果与本研究结果类似。

综上所述，本研究建立了可靠的检测尿液儿茶酚胺的LC-MS/MS方法，能同时检测尿液中的E、NE和DA浓度，采用同位素内标法定量，操作简便，分析时间短，样本用量少，灵敏度和特异性较高，适用于临床嗜铬细胞瘤和副神经节瘤这类分泌儿茶酚胺肿瘤的辅助诊断。

参考文献

[1]DE JONG WH，DE VRIES EG，WOLFFENBUTTEL BH，et al. Automated mass spectrometric analysis of urinary free catecholamines using on-line solid phase extraction[J]. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci，2010，878(19)：1506-1512.

[2]PEITZSCH M，PELZEL D，GLÖCKNER S，et al. Simultaneous liquid chromatography tandem mass spectrometric determination of urinary free metanephrines and catecholamines，with comparisons of free and deconjugated metabolites[J]. Clin Chim Acta，2013，418：50-58.

[3]CLARK ZD，FRANK EL. Urinary metanephrines by liquid chromatography tandem mass spectrometry:using multiple quantification methods to minimize interferences in a high throughput method[J]. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci，2011，879(31)：3673-3680.

[4]化学药物临床药代动力学研究技术指导原则[S].GCL1-2，2005.

[5]BICKER J，FORTUNA A，ALVES G，et al. Liquid chromatographic methods for the quantification of catecholamines and their metabolites in several biological samples-a review[J]. Anal Chim Acta，2013，768:12-34.

[6]KUMAR A，HART JP，MCCALLEY DV. Determination of catecholamines in urine using hydrophilic interaction chromatography with electrochemical detection[J]. J Chromatogr A，2011，1218(25)：3854-3861.

(本文编辑：龚晓霖)