质谱分析在遗传代谢性疾病临床检验诊断中的应用

张春花

质谱分析在遗传代谢性疾病临床检验诊断中的应用

张春花

(日本国际松本生命科学研究所，日本 金泽 921-8105)

摘要：质谱分析技术已被公认为是代谢性疾病化学诊断的有用手段。气相色谱质谱联用法可以对130余种代谢疾病进行筛查和化学诊断，串联质谱法可同时筛查30余种脂肪酸代谢异常疾患和部分氨基酸代谢异常，因而被世界各国广泛用于新生儿先天性代谢疾病的筛查。应用质谱分析技术分析诊断遗传代谢疾病的实验室逐年递增，但其实验操作较为繁杂。临床实验室国际标准化管理是保证质谱分析技术为临床检验服务的前提。网络化实验室体系可以简化实验室的操作，保证良好的实验室管理。

关键词：质谱；代谢性疾病；气相色谱质谱联用；串联质谱

Application of mass spectrometry for the clinical diagnosis of inborn error of metabolismZHANGChunhua

.(MatsumotoInternationalInstituteofLifeScience，Kanazawa912-8105，Japan)

Abstract:For the clinical diagnosis of inborn error of metabolism, the technique of mass spectrometry is considered to be an important tool. Gas chromatography/mass spectrometry can be used in the screening and diagnosis of more than 130 inborn errors of metabolism. Tandem mass spectrometery can screen about 30 fatty acid disorders and amino acid disorders, so it is applied into neonatal screening around the world. The number of laboratories using mass spectrometry for the diagnosis of inborn error of metabolism is increasing, but the organization of mass spectrometry analysis is very difficult. Internationalization management is the precondition for the quality control of inborn error of metabolism determination in clinic. The on-line mass spectrometry network system can overcome difficult procedure and keep high quality for laboratory management.

Key words:Mass spectrometry； Inborn error of metabolism； Gas chromatography/mass spectrometry； Tandem mass spectrometry

自1902年英国Garrod教授发现尿黑酸尿症以来，先天性代谢性疾病逐渐被认知。目前，全世界已发现了500余种先天性代谢疾病。这些疾病的整体发病人数虽多，但是每一种疾病的发病率相对较低，其临床表现缺乏特异性，导致临床诊断依赖于特殊实验室的检查数据。根据这类疾病的发病机制(由于体内生化代谢中的酶催化反应受损导致体内代谢紊乱，从而继发临床症状)的特点，其相应的特殊检验方法需要尽可能的满足同时监测全面的代谢产物的紊乱状态，从而推测出代谢紊乱诱发的反应阻滞环节，得出反应异常酶的靶向定位。但长期以来，一般医院的实验室无法实现对上述代谢紊乱的监测，先天性代谢疾病的诊断也长期处于检验手段不完善的状态之下。20世纪60年代初期开始的层析加质谱分析技术的代谢组学研究和医学应用恰好对上述代谢病的检测需求作了补充。随着近年来对疾病谱研究的深入和分析仪器设备技术的更新，质谱分析在医学检验领域中的应用不断得到扩展。在此对行代谢性疾病质谱分析的医学实验室的实际配置应用和管理方面进行阐述。

一、质谱技术在医学应用领域中的发展历史

最近10余年以来，质谱分析在医学临床诊断和研究方面变得非常普遍。提及质谱分析，会联想到“气相色谱质谱联用”、“串联质谱”、“遗传代谢病”、“新生儿筛查”、“维生素D”、“儿茶酚胺”、“药物浓度监测”等一系列关联词，甚至在医学检验领域中，液相串联质谱被视为新时代检验的核心技术。临床医生在多种临床疑难或遗传性疾病诊断方面出现了一种过度依赖于质谱分析的倾向。事实上，质谱分析技术在医学检验领域中的应用已有将近40年的历史。

1966年，TANAKA博士[1]采用气相色谱质谱联用(gas chromatography/mass spectrometry，GC/MS)技术对患者的尿液和血液进行分析，初次发现了异戊酸血症。这个发现提示了质谱分析技术可以用于医学临床诊断。20世纪70年代初期，国际上开始采用GC/MS对先天性代谢疾病的诊断进行研究。1973年日本著名遗传代谢病学者MATSUMOTO等[2]首先创建了有机酸血症的GC/MS分析法，作为有机酸血症的独特的诊断方法为100余种先天代谢病的临床诊断提供了有力的参考依据。1993年，作者参与MATSUMOTO等的研究小组对原有机酸血症的GC/MS分析法做了改良，提出了尿素酶前处理法的新的遗传代谢病化学诊断体系。新的体系不仅能诊断有机酸血症，同时还可以检出氨基酸血症、糖代谢病、脂肪酸、核酸代谢疾病，扩大了GC/MS技术在先天性代谢疾病诊断方面的应用范围[3-5]。目前，在日本松本生命科学研究所(Matsumoto International Institute of Life Science，MILS)，经过MATSUMOTO等学者40余年的研究，现已能通过尿液分析对130余种先天代谢病进行筛查[6-9]，为儿童遗传代谢病的诊断和治疗提供了重要的参考依据，同时为遗传代谢病的分子诊断学研究提供了绝佳的导航效应，促进了世界性的遗传代谢病研究。同期美国物理学家MILINGTON等[10]应用串联质谱(tandem mass spectrometry，MS/MS)法，通过检测干燥滤纸血斑中的脂酰肉碱诊断20余种脂肪酸代谢异常疾病。之后RASHED等[11]和CHACE等[12]对该技术进行了改良，在分析干燥滤纸血斑中的脂酰肉碱的同时联合氨基酸分析可同时筛查脂肪酸代谢异常和部分氨基酸代谢异常。这个方法的建立推动了全球性的新生儿筛查。通过近20年的基础研究，MS/MS法新生儿筛查几乎普及到了全世界。近10年以来，联合GC/MS、MS/MS、电泳层析色谱质谱联用(capillary electrophoresis/mass spectrometry，CE/MS)、飞行时间质谱(time-of-flight mass spectrometry，TOF-MS)技术对体液和组织进行分析，综合所有检测信息对生物体的代谢组学及蛋白组学进行研究的手段更得到了医学和药学界学者的瞩目，特别是在未知病态的病因病理学解析、诊断生物指标的探索、经验医学的数字化量化解析、药物治疗效果的评估等方面，质谱分析的代谢组学以及蛋白组学研究可列为最前沿的研究技术[13-14]。

二、质谱分析在遗传代谢病检查中的应用现状

随着仪器厂商不断改进技术，质谱仪的操作已相对简单，但在作为常规临床检验仪器应用方面与目前检验科正在使用的自动生化分析仪等大型自动化仪器相比还存在着诸多操作、维护及稳定性方面的问题。因此，很多质谱分析仪器尚未取得医疗分析仪器的认证。大部分的质谱仪都由专业人员进行操作和管理，其用途也多用于研究和特定项目检测。目前，在实际临床应用中相对比较成熟的遗传代谢性疾病质谱检测技术主要为MS/MS和GC/MS。

1. MS/MS技术MS/MS技术是利用液相层析原理加上双重质谱分析实现快速分析含有同样官能基结构的同类化合物的目的。目前，MS/MS技术主要用于检测血清或滤纸血斑中的酰基肉碱成分及氨基酸成分，对20多种遗传代谢病进行筛查。该方法的优点是标本处理简单、检测所需时间短(每份标本只需2 min)、可通过一定参数的变动判断结果，可快速推测筛查对象疾病的可疑性；缺点是其结果易受多种因素影响，容易产生假阳性，且其结果大部分需借助尿液GC/MS分析等其他分析手段来确认。

2. GC/MS技术GC/MS技术的原理是利用气相层析加质谱技术对可气化的物质进行定性和定量检测、分析样本采集时的代谢产物组学。GC/MS技术目前主要用于分析尿液中100～300种代谢成分，对30～130多种异常代谢病诊断线索的有无进行筛查。GC/MS技术的优点是作为代谢性疾病诊断的辅助手段进入医学临床应用历史较长，其技术得到了长时间验证和改良，同时在世界性的遗传代谢性疾病的研究和病例数据积累方面有较为坚实的参照基础，并可通过代谢产物的分析组合提升对新的遗传代谢疾病的认知；其缺点是标本的气化衍生前处理过程相对繁琐，标本前处理的方法和人为操作会影响结果，检测时间较长(每份标本需20～60 min)，结果判断需要数据解读人员掌握全部代谢成分的质谱特征，理解正常代谢谱的分布状态和可变动范围，识别代谢紊乱的代谢异常环节和位点，在此基础上做出代谢分析的结果判断和异常提示。该分析结果一部分非常接近于临床诊断，一部分需要借助临床其他检查和分子生物学检测确认诊断，还有一部分是对临床疾病的异常代谢组学的解释。因此，对该结果的使用和理解需结合遗传代谢性疾病专家的意见、临床患者资料及用药资料综合进行[15]。

三、遗传代谢病质谱分析的实验室管理

虽然质谱技术在遗传代谢病研究和诊断方面已经有很久的历史，但目前尚无完善的实验室标准化管理流程。大部分实验室依靠常年的经验来实现送检标本的检测分析和结果判断，并提供该实验室的检测报告。因此常常会出现代谢病患者虽然采用质谱分析进行代谢病筛查，但未能明确诊断，进而导致医疗纠纷的案例。这也是该技术和该项目发展成熟期不可避免的弊端。中国的遗传代谢病质谱分析在20世纪90年代末期开始开展，2003年以后在北京、上海、广州、武汉等地逐渐开设了GC/MS和液相色谱-质谱/质谱联用(liquid chromatography-mass spectrometry/mass spectrometry，LC-MS/MS)分析实验室。截至到2013年，已经注册的质谱分析实验室已达40余家。各实验室使用的仪器设备不同，标本的前处理方法有差异，数据分析有依赖软件操作和技术人员人工判读两种方式。因此出现了同一患者持有不同的质谱分析实验室的检测报告到处求医会诊的现象。由于各实验室的结果各不相同，患者及家属困惑，临床医生也困惑。最近作者常常收到不同实验室发来的患者检查结果的邮件，希望对其检查结果给出综合意见。在处理和应对这些咨询邮件的同时我们强烈感觉到需要纠正和理顺代谢病质谱分析的无标准化操作的现状。建议质谱分析实验室参照以下标准规范遗传代谢病的筛查。

1. 标本采集、保存和转运用于代谢病分析的常规标本有血液和尿液2种。为了保证有效、准确的检测结果，标本的采集方法、采集时间、保存条件及标本传递过程中的注意事项非常重要。质谱分析主要对标本采集时的代谢成分的存在状态(质和量)进行检测，因此标本采集时间的选择一定要严格遵照检验单的要求。固化标本采集时的代谢成分状态、中止已采标本内各种酶反应和异构体转化的最佳方式是迅速冷冻，因此代谢病筛查标本多采用-20℃保存。标本转运过程中需注意标本间的污染、环境污染及冷冻温度控制，同时保持独立标本放置空间，避免该标本对外的病原学感染。实验室接收标本时要严格按上述条件确认标本保存状态是否合格。

2. 标本处理方法目前用于代谢病筛查标本的处理方法根据质谱仪种类不同分为两类。第1类是用于LC-MS/MS的血液标本，可以分为血清和干燥滤纸血斑两种。用于血酰基肉碱和氨基酸分析的标本处理方法如下：采集相当于3.2 μL全血的3 mm直径滤纸血斑或血清，加入含氨基酸和酰基肉碱同位素内标的甲醇，提取血中的氨基酸和酰基肉碱，然后用衍生法或非衍生法处理，最后进样分析。衍生法或非衍生法均可采用商业化试剂，常用的有美国CIL公司(Cambridge Isotope Laboratories Inc.)的NSK-A and NSK-B同位素内标和美国PerkinElmer公司的NeoBase 试剂盒，前者需要自备仪器分析使用的流动相溶酶，而后者试剂盒中提供了仪器分析使用的流动相溶酶。衍生法和非衍生法的选择主要取决于所用质谱仪的敏感性。衍生法可以提高微量成分的检出敏感性。但是对于目前由各大厂商提供的最新型号的质谱仪来说，用非衍生法处理的标本的检测灵敏度已经达到衍生法的要求，既可以简化标本前处理流程又可以节约试剂成本。但对于一些型号比较陈旧的质谱仪，必须用衍生法处理标本。第2类是用于GC/MS的尿液标本，可以分为原尿和干燥滤纸尿两种。用于尿液中代谢成分谱的标本处理方法主要有有机溶媒提取法和尿素酶处理法。有机溶酶提取法的主要原理是在酸化条件下用双乙基醋酸反复3次提取，获取尿液中含有羧基的有机酸成分，然后经气化衍生进行质谱分析。尿素酶处理法的主要原理是在尿液中加入尿素酶，分解尿中大量存在的尿素，然后对所有含有羧基、氨基、羟基的代谢成分进行气化衍生并进行质谱分析。有机溶酶提取法仅能进行有机酸成分分析，其结果用于有机酸血症的诊断。尿素酶处理法不仅可分析有机酸，还可对氨基酸、糖、核酸类成分进行分析，其结果可用于更广泛的代谢病的分析诊断。两种尿液标本前处理方法的比较见表1。

3. 质谱仪的选择目前，用于代谢疾病筛查的主要仪器型号及其生产厂商见表2。各仪器厂商都配有一定程度的代谢病筛查分析软件。LC-MS/MS和GC/MS仪器的选择主要是围绕代谢疾病筛查分析的配套软件和仪器性能维护服务。

表1　有机溶媒提取法和尿素酶处理法的比较

表2　质谱仪的选择

注：数据截止至2013年

4. 仪器分析方法的设定(1)LC-MS/MS：LC-MS/MS的仪器设定基本比较统一，各实验室间的差异主要在于测定成分的种类，如氨基酸中难度较大的碱性氨基酸的测定(对各种碱性氨基酸如赖氨酸、鸟氨酸、精氨酸、瓜氨酸、组氨酸等的精确检测有利于多种氨基酸代谢异常的鉴别诊断)，还有就是对酰基肉碱中长链酰基肉碱的检出敏感性和稳定性问题(含20碳以上的酰基肉碱的准确检测有利于长链或极长链脂肪酸代谢异常疾病的鉴别诊断)；(2)GC/MS：不同的实验室在GC升温条件和毛细层析柱方面均有各自的侧重和差异。不同的层析柱种类和升温条件会导致部分检测成分出现差异。质谱分析的检出模式建议采用电子冲击离子化全扫，这样会获得更全面的代谢谱信息。

5. 数据判读解读质谱分析得到的数据非常关键。由于大部分人体代谢产物没有标准品可供参照，仪器本身配套的通用质谱库也不能满足全部体液成分的定性分析，所以通过辨认质谱图中每个检出波峰，对所有检出成分进行定性是一个繁琐和专业的过程，这相当于把非常抽象的物理学数据翻译成医学专业用语。这个过程需要由经过专业培训、具备专业知识的技术人员来完成，其判读结果是后期疾病诊断的重要参考资料。

6. 结果分析数据判读得到的结果反映了人体代谢的代谢谱状态。这个状态是正常还是异常的判断归结于结果分析，其分析基准包括代谢谱的分布是否处于正常状态、应该检出的成分指标是否在正常范围内、不应该检出的成分是否被检出、各成分之间的比例平衡是否被打乱、出现代谢不平衡时不平衡出处在哪里，在人体代谢图谱中位点定位如何等，由此推测出代谢疾病的可能代谢障碍环节。结果分析是代谢紊乱原因探索的关键，直接影响疾病的临床诊断。因此建议由掌握正常人体代谢、熟知代谢成分的生物化学意义和代谢图谱中各种代谢途径的医学生化学专业人员来完成。

7. 报告制作和发送根据数据判读、结果分析得到的资料做出本次质谱分析的检查报告。遗传代谢病在临床上属于罕见病、疑难病，临床医生碰到的机会稀少，对待这类疾病的临床经验浅薄，所以代谢病分析报告需要提示代谢分析的异常点在哪里、造成异常的原因有哪些、可以提示的遗传代谢病是哪种、这种代谢病的临床特点有哪些、如何最终诊断这种代谢疾病、如何治疗和追踪随访这种代谢病，由此完善和实现遗传代谢病质谱分析的实际意义。因此，遗传代谢病检验报告的制作建议由有遗传代谢病专业背景的医学专家来参与完成。

8. 质控管理(包括室间质评、室内质控及国内、国际质控)上述标本采集、处理、检测、结果分析、报告形成的一系列过程需要按照严格的标准化操作流程来实施。与其他检验科项目相同，质谱分析结果质量的评估最终要归结为质控管理，但质谱分析目前还没有很标准的质控管理程序。各家实验室均采用自家标准监测每次实验情况，通过对仪器的强检最大限度的排除仪器设备带来的实验误差。在室间质评方面，中国卫生部临床检验中心2013年开展了全国新生儿遗传代谢病串联质谱筛查-氨基酸(血斑)和酰基肉碱(血斑)室间质控评价活动。这项室间质评活动刚实施了2年，数据还有待于积累和改善。在国际上，美国疾病预防控制中心(Centers for Disease Control and Prevention，CDC)的室间质评管理体系面向全世界，开展的评估活动有相对较长的历史，积累了很多的经验，但采用的质控标本多为人为制作的标本，对实际患者的检测评估方面稍有不尽意之处。近10余年来比较权威的代谢病室间质评管理机构为欧洲遗传代谢病筛查评改和诊治研究网络(European research network for evaluation and improvement of screening, diagnosis and treatment of inherited disorders of metabolism，ERNDIM)。该机构是由世界权威代谢病专家组成的监督组织，积累了大量代谢病患者的标本资料，采用实际已确诊的患者标本进行质控管理评估。目前已有上百家代谢病专业实验室参加由其组织的室间质评活动。日本MILS已有10年的参加经验。ERNDIM的管理体系近年也在不断完善，其使用的室间质评标本来源于患者，结果评估非常客观、实际，值得推荐。在此也建议实验室室内质控也尽可能选用患者标本，因为患者标本最客观，能反映仪器检测质量，保证准确、高效的检验服务。

四、遗传代谢病质谱分析实验室的国际化

遗传代谢病的实验室检测是一个非常复杂且要求技术和人员配置非常高端的检验项目，临床医生对实验室结果的依存度高，实验室检测中各个环节产生差异都将直接影响临床医生的资料参照、临床诊断、治疗及预后。为了能提供高质量的代谢病质谱分析检验结果，作者最近10年创立了国际代谢病网络实验室体系，其示意图见图1。

图1国际化代谢病质谱分析网络实验室体系示意图

国际代谢病网络实验室体系的核心是对实验室配置、标本处理方法及仪器分析方法进行固化，仪器分析后的数据集中到数据分析中心。数据分析中心拥有数据解读、结果分析、报告制作和合成的熟练的专业技术人员，可以随时对接收到的数据进行分析并做出最完善的结果报告返回给数据来源实验室，最后通过当地实验室完成末端临床检验服务。计划开展代谢病质谱分析的医疗机构可以申请加入该体系，获得该医疗机构的代谢病实验室编号和配有网络实验室配置的全套实施办法、细则以及实验室标准操作流程文件，按要求完善实验室配置和标本处理分析后，把分析数据通过固定网络端口传送至网络实验室数据分析中心。数据分析中心会在规定时间内返回分析报告，然后实验室将返回的分析报告转送给临床医生。这个体系的优点是质谱分析实验室本身不需要进行长期的技术人员培训，也不需要配备数据解读和结果分析的专业技术人员，但随时可以获得国际代谢病质谱分析技术服务，是新开展遗传代谢病筛查的实验室的检测质量快速与国际接轨的绝好的捷径。经过近10年的发展，国际代谢病网络实验室体系中已积累了大量世界各国代谢病患者的资料，对各地区人群代谢病发病谱的分析也有了很大的资源、资料可循。该体系的数据分析中心由来自世界各国的代谢病分析研究专家参与，可提供世界各国的代谢病临床咨询服务。

五、结论

本文围绕遗传代谢病的质谱分析发展的历史、目前质谱分析在代谢病分析诊断方面的现状以及遗传代谢病筛查实验室的管理办法做了阐述。同时介绍了高效现代化的代谢病分析实验室国际网络体系的操作模式，希望能对大家在组建和管理代谢病筛查实验室方面有所借鉴。

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(本文编辑：龚晓霖)

收稿日期：(2014-12-21)

中图分类号：

文章编号：1673-8640(2015)05-0410-06R446.1

文献标志码：ADOI：10.3969/j.issn.1673-8640.2015.05.002

作者简介：张春花，女，1963年生，博士，研究员，主要从事遗传代谢病研究。