促进自体脂肪移植血管形成的研究进展

王明龙, 章建林

作者单位：200003 上海，第二军医大学附属长征医院 整形外科



促进自体脂肪移植血管形成的研究进展

王明龙, 章建林

脂肪移植； 血管形成； 自体脂肪

临床上对于外伤、肿瘤、先天性发育不良等原因导致的软组织缺失，或正常情况下的美容手术，常用的治疗方法有皮瓣移植、假体置入、软组织填充等。软组织填充由于创伤小、效果佳、可塑性强，而成为较常用的治疗手段之一。临床常用的填充物，如硅胶、胶原蛋白和玻璃酸钠等均存在排斥反应，或术后疗效不持久的缺点。自体脂肪移植则是解决以上问题的有效办法，自体脂肪组织具有来源丰富、取材方便、无免疫排斥反应等优点。但目前自体脂肪移植的临床效果并不理想，游离脂肪细胞移植，早期受区血供差等原因，导致其存活率低，部分液化、坏死、钙化，吸收率为30%～70%，限制了其在临床上的广泛应用。因此，如何促进移植脂肪细胞血管化，从而提高存活率成为临床脂肪细胞移植迫切需要解决的问题。脂肪组织血液供应特点：⑴成熟的脂肪组织中，仅10%单房成熟脂肪细胞占据超过90%的空间体积，其余90%细胞占据10%空间体积。体积庞大的脂肪细胞垂挂在血管支架上，每个细胞都有单独的血管供应系统与主干相连，有学者形象地将脂肪组织结构比喻为“葡萄串”样结构。⑵成熟脂肪细胞是高能耗细胞，非常脆弱，对血液供应的要求很高。⑶在移植物与宿主建立充分的血供之前，脂肪组织只能靠周围组织液的浸润和渗透来维持营养供应，这种供应的距离极为有限，仅为150～ 200 μm，超过200 μm会出现缺血坏死。由于脂肪组织血供的特殊性，也为脂肪移植血管化的研究带来了很大困难。

对于脂肪移植存活率及血管化的影响大致与以下4点有关：⑴移植脂肪的供区；⑵移植的脂肪的质量；⑶受区(即手术脂肪移植区)的术前处理；⑷术后护理等。目前各种研究主要在前3个方面。以下就前3点，对目前各种促进自体脂肪游离移植成血管化的研究进行文献复习。

1 不同供区脂肪的对移植脂肪血管化的影响

有学者对机体各部位皮下脂肪组织的研究发现，脂肪细胞的活性、移植后移植物的质量及组织形态学均无明显差别。但下腹部与大腿内侧脂肪组织中的脂肪细胞和脂肪间充质干细胞数量较高，并且这些部位的脂肪细胞具有α2受体[1]，其具有抗脂肪分解及对营养反应较低的特性，其移植后存活的可能性较大。目前研究证明，脂肪来源干细胞分泌多种细胞因子，如血管内皮生长因子、转化生长因子、肝细胞生长因子、胎盘生长因子、胰岛素样生长因子和血管生成素等[2]。有研究发现，脂肪来源干细胞具有促血管化和抗凋亡的潜能。因此，不同部位脂肪对于移植脂肪血管化具有一定的影响。

2 移植脂肪的质量

移植脂肪的质量不同对移植后脂肪血管化的影响起决定性作用，目前，大部分对于促进移植脂肪血管化的研究也主要集中在增强移植脂肪的质量方面，主要方法大致为：⑴利用各种细胞因子、生长因子辅助脂肪移植血管化。⑵各种细胞因子+脂肪来源干细胞辅助脂肪移植及各种细胞因子基因转染的脂肪来源干细胞辅助脂肪移植。⑶组织工程方法增强脂肪移植血管化。

2.1 各种细胞因子辅助血管化的研究

2.1.1 胰岛素对移植脂肪组织成血管的促进作用 近年来研究发现，胰岛素具有促进血管内皮细胞分裂增殖的作用。增加血管内皮生长因子的分泌，并能有效地促进大鼠前脂肪细胞的增殖和分化。研究表明，低浓度胰岛素对细胞的增殖分化和血管内皮细胞的增殖，以及血管内皮细胞生长因子的表达具有明显的促进作用，而高浓度的胰岛素反而有抑制作用[3-4]。邓颖等[5]研究表明，微血管免疫组化观察显示，脂肪移植10、20 d两组比较，差异有统计学意义(P<0.05)，微血管密度随着时间的推移增多，微血管增生在移植后前20 d增加较快，20～28 d新生血管增加速度变缓。胰岛素微血管密度组明显大于对照组(P<0.01)，实验结果显示，脂肪移植后10 d，可见明显的微血管重建现象，胰岛素组在移植后20 d，血管生长达到高峰，28 d时仍有血管生长，但生长变缓慢。对照组微血管生长在移植后28 d达到高峰，迟于胰岛素组。本研究证明，胰岛素对自体脂肪移植组织的血管再生起到促进作用。2.1.2 成纤维细胞生长因子辅助移植脂肪血管化 目前对酸性成纤维细胞生长因子和碱性成纤维细胞生长因子进行研究。申在旭等[6]在脂肪移植隆乳术中应用酸性成纤维细胞生长因子预处理的脂肪干细胞辅助脂肪组织移植，通过与对照组未处理的脂肪干细胞辅助脂肪移植对比，结果表明，治疗组术后1、3个月，隆起增加值分别为(13.8±2.9) mm，(12.9±3.6) mm；隆起维持率分别为86.7%、80.0%。对照组术后1、3个月隆起增加值分别为(12.4±1.7) mm，(11.2±1.4) mm；隆起维持率分别为66.7%，59.5%。对照组脂肪隆起减少更明显。2组比较差异有统计学意义(P<0.05)。另有研究显示，酸性成纤维细胞生长因子可刺激脂肪细胞增殖分裂，减少脂肪细胞凋亡，促进血管内皮细胞增殖，促进血管生长，增加脂肪的供血。2000年，E Yuksel等认为，除了各种因子的促前脂肪细胞分化增殖作用外，碱性成纤维细胞生长因子促血管再生的活性，为移植体构建了良好的生存环境，也可能在促进移植体存活方面起到了重要作用。靳元嵘和杨瑟飞[7]的研究也证明，碱性成纤维细胞生长因子可以更好地促进脂肪移植体早期血运重建。

2.1.3 血管内皮生长因子对移植脂肪组织成血管的促进作用 对血循环重建而言， 血管内皮生长因子作为血管内皮细胞的特异性丝裂原，是血管形成重要的调节因子，在新生血管形成过程中起着重要的作用。并且在一些血管内皮生长因子撤退性研究中发现，血管内皮生长因子撤退后，出现生理性及病理性的血管退化现象，进一步证明血管内皮生长因子在成血管机制中的重要作用。血管内皮生长因子可促进移植组织内的血管增生和脂肪细胞的分化增殖。2011年，JG Rasmussen等研究腺病毒介导的血管内皮生长因子对血管生成的影响，及对游离脂肪移植物存活率的影响，结果证明，血管内皮生长因子诱导血管的生成，提高了脂肪移植存活率。Chung等[8]将血管内皮生长因子包装到微球体缓释装置中，分为3组：血管内皮生长因子微球体组、空微球体组、脂肪提取物对照组，皮下注射，第3、6周组织检测显示，血管内皮生长因子组质量和体积都有增加，另两组质量和体积减少；CD31+、伊红和苏木精染色观察，血管内皮生长因子微球体组血管密度明显多于另两组。有研究表明，血管内皮生长因子和血小板源性生长因子共同作用，可以促进脂肪组织血管化。

2.1.4 富血小板血浆对移植脂肪组织成血管的促进作用 富血小板血浆是通过离心自体全血，而获得的血小板浓缩物。富血小板血浆中生成血管的生长因子成分包括：间质细胞衍生因子-1、胰岛素样生长因子-1、碱性成纤维细胞生长因子和血管内皮生长因子等。而其含有的因子也均被研究证明，具有促进移植脂肪血管化的作用。Li等[9]的动物研究结果发现，移植组织无炎症和脓肿形成；实验组在血管再生、脂肪液化坏死方面都要好于对照组；在l5、30和90 d后，实验组的移植脂肪的质量和体积，均显著大于对照组(P<0.05)；组织学观察得出，在15、180 d后，实验组的微血管数量显著多于对照组(P<0.05)。Willemsen等[10]通过问卷调查获取患者的满意度和结果。以上研究表明，富血小板血浆混合自体颗粒脂肪组织移植，能加速移植组织早期血管重建，避免纤维化和脂肪细胞凋亡。

2.1.5 其余对移植脂肪组织血管化具有促进作用的细胞因子研究 此外，如在红细胞生成素、雌激素[11]、血小板源性生长因子、转化生长因子B、血管生长素、肝细胞生长因子、透明质酸水凝胶等的研究中，大部分研究都得出了可促进移植脂肪组织血管化加速的结论，但对各种生长因子及细胞因子来说，主要有作用的持续性和剂量的把控问题。有学者研究出多次注射及各种微量控释装置，将所用的细胞因子放入控释装置，从而减少降解率，并控制局部浓度，最终延长其效用时间。如可降解多孔层结构或预包埋的微球生物材料等。

2.2 与脂肪干细胞联合移植及各种辅助细胞因子的作用

2006年，K Yoshimura等提出脂肪来源干细胞协同自体脂肪移植的概念。此后对于脂肪来源干细胞的研究纷纷展开。2.2.1 血管基质组分辅助脂肪组织移植血管化 血管基质组分是一种混合组分，其中包含多种细胞、干细胞和祖细胞[12]。Kim等[13]的研究表明，血管基质组分与脂肪来源干细胞对于脂肪移植成活起到一定的作用，对移植脂肪的血管化起到了促进的作用，虽然脂肪来源干细胞具有多重分化功能，可分化为脂肪细胞、软骨细胞、骨细胞等[14]，但本研究显示，其新生血管并非脂肪来源干细胞分化而成。

2.2.2 脂肪来源干细胞+血管内皮细胞生长因子 2007年， CG Yi等利用腺病毒做血管内皮细胞生长因子的载体，并混合人类脂肪组织后注入到动物头皮下。2组对照组则分别注入绿色荧光蛋白基因-人类脂肪组织混合物和生理盐水。经过一系列处理后结果显示，实验组的毛细血管密度显著增高(P<0.01)，其脂肪移植组织的质量和体积明显高于对照组(P<0.05)。Lu等[15]利用血管内皮细胞生长因子基因转染的脂肪来源干细胞辅助脂肪移植血管化实验，注入裸鼠背部皮下4个区域，6个月后，毛细血管计数结果实验组移植物质量较大，脂肪液化坏死及钙化均明显少于其他组，差异有统计学意义(P<0.05)。杨波等[16]用血管内皮细胞生长因子165基因转染脂肪来源干细胞，促进移植脂肪血管化，同样证明了其有效性。

2.2.3 脂肪来源干细胞复合各种细胞因子促进移植脂肪血管化的方法 脂肪来源干细胞复合富血小板纤维蛋白促进移植脂肪血管化[17]，肝细胞生长因子转染的脂肪来源干细胞促进移植脂肪血管化，重组人血管内皮细胞生长因子的脂肪来源干细胞和前列腺素E1促进移植脂肪等。还有多种细胞因子及生长因子以复合或转染脂肪来源干细胞的方式，用于促进脂肪移植的血管化，其中大部分研究都得出了可促进移植脂肪组织血管化加速的结论，且解决了单独细胞因子早期降解及最适剂量等时效问题。

2.3 组织工程方法促进脂肪移植血管化的方法

2.3.1 脂肪组织工程促进脂肪移植血管化 组织工程技术已经应用于脂肪移植术，但核心问题仍然是血管化的问题，机体脂肪组织高度血管化，血流供应和毛细血管密度是骨骼肌组织的2～3倍。因此，学者们达成了一种共识：组织工程组织的构建受限于构建组织的血管化程度。如何解决组织工程脂肪组织的血管化问题，学者们做出了不同的尝试。有研究发现，血管内皮细胞生长因子和碱性成纤维细胞生长因子在纤维素支架材料中联合应用，能够明显促进组织工程脂肪血管化，而这正是脂肪细胞再生和维持所必需的。利用转基因技术可使种子细胞表达重组促血管生成生长因子，并释放促血管生成生长因子，提高组织工程脂肪血管化水平。1999年，LO Shea等将编码血小板源性生长因子的质粒DNA引入聚乳酸乙酸共聚物支架中，体内外实验均观察到组织血管形成加速。2000年，MJ Wissink等利用肝素与碱性成纤维细胞生长因子结合，特性构建碱性成纤维细胞生长因子控释体系；将碱性成纤维细胞生长因子控释体系结合到胶原支架上埋植于大鼠皮下，支架内血管长入明显加快。

2.3.2 组织工程室 2003年，SO Hofer等将在体血管放入生物惰性材料，制作有一定硬度的组织工程室，为培养组织提供血管基础、营养物质和生长所需空间，称为血管化的组织工程室。2007年，JH Doldercr等在大鼠体内构建了以腹壁下浅动脉为蒂的脂肪瓣在组织工程室内自发生长模型，6周后组织工程室内脂肪瓣体积从0.08 ml增加到1.20 ml。ML Moya等将成纤维细胞生长因子-1添加到软藻酸盐微支架上，发现与加入单纯FGF-1相比，能观察到更明显的血管化。组织工程室不仅为室内组织生长提供所需空间，促进血管出芽，增加室内组织的体积，构建出相对独立空间，还可进行进一步的实验干预，如局部应用一些生长因子或诱导因子加速室内组织生长。

2.3.3 组织工程共培养体系 脂肪组织工程中的共培养策略，主要是将种子细胞与内皮或内皮祖细胞共同培养，以在工程脂肪中建立良好的血供为目的。一种细胞释放一种特定的物质，与另一种细胞表面受体结合，促进其产生一定的生物性效应[18]。Strassburg等[19]的研究显示，脂肪来源干细胞增强了内皮祖细胞的成血管能力。2011年，JH Choi等的研究表明，人脐静脉内皮细胞对脂肪来源干细胞的成脂功能具有促进作用。虽然共培养体系促进移植脂肪的血管化更有优势，且近期也应用到多领域，但脂肪组织共培养体系中内皮祖细胞较难获取，兼容两种细胞特性的生物支架较少，及2种细胞的培养比例等问题仍待解决。

3 受区(即手术脂肪移植区)的术前处理

采用负压真空隆乳装置隆乳已有100多年历史。最近的brava负压真空隆乳装置联合脂肪移植在临床的应用取得了可观的效果。 Heit等[20]的基础研究解释了以上实验成功的原因。以小鼠为实验对象，通过连续长时间的负压真空吸引结果显示，外扩张21 d局部组织出现肿胀；28 d是时皮下脂肪层厚度倍增，MRI结果一样。扩张部位皮下层细胞倍增，脂肪细胞数增至原来的2.2倍；血流灌注显示，28 d时，实验组皮下组织血管密度为对照组的1.9倍，处理组7 d时，观察到机械刺激作用导致血管构筑，血管以再定位和官腔增大的形式发生强烈重塑。

4 讨论

通过以上文献复习，无论是供区的选择，添加各种细胞因子提高移植脂肪质量，脂肪组织工程技术，还是术前受区的真空负压扩张处理，最终目的都是以促进脂肪移植的血管化，提高脂肪移植存活率。以上总结了近年来较有潜力的促自体脂肪移植组织血管再生的物质及其研究方法，大部分都取得了一定的成果，但有很多的问题尚未解决：⑴超早期血管化，超早期移植脂肪缺氧与营养供应。⑵移植脂肪中心坏死区的保存。人类脂肪组织抽吸物在移植后3～4周按组织学分类可分为3种区域：外周区域(活性脂肪细胞)、过渡区域(炎性过程)和中央区域(坏死区域)。移植早期的外周区细胞由周围原有组织渗透的血浆提供的代谢环境保持活性，其渗透的范围为距离软组织300 μm内[21]。⑶移植的脂肪最终细胞是原移植细胞存活,还是新生的脂肪细胞，再生细胞的数量、比例、最大可达到的体积和数量及其机制问题。大多数研究显示,在最初移植的脂肪经历体积减小后一般在5～7 d会有体积的增加。综上所述,尽管我们已经做了很多研究探索脂肪移植血管化的问题，尽管取得了一些成果，但上述关键问题仍亟待解决。

目前研究普遍认为，内皮祖细胞(endothelial progenitor cells, EPC)是血管内皮细胞的前体细胞，因此,又称为血管内皮干细胞,是参与生理性及病理性血管形成最主要的细胞。然而EPC生理状态下较少存在于外周，EPC的体外培养较困难，而且长期培养后易分化,失去成血管能力,限制了其应用。大量研究表明，基质细胞衍生因子-1α是EPC的强大趋化剂，其通过与EPC表面的特异性基质细胞衍生因子-1α特异性受体结合，在短时间内即可迅速动员骨髓中EPC进入外周血，并介导外周血中EPC迁移、归巢到缺血缺氧组织局部，从而参与了血管新生及损伤血管的重新内皮化[22]。由此我们设想，可以构建一种承载基质细胞衍生因子-1α基因的病毒转染脂肪来源干细胞，将转染的脂肪来源干细胞混合脂肪颗粒共同移植，在受区缺氧刺激下，脂肪来源干细胞大量分泌基质细胞衍生因子-1α，从而趋化EPC进入移植区参与血管构建，加速移植物早期血管建立，最终提高移植脂肪存活率。

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上海市自然科学基金资助项目(124119a0701)

作者单位：200003 上海，第二军医大学附属长征医院 整形外科

王明龙(1987-)，男，辽宁朝阳人，硕士研究生.

章建林，200003，第二军医大学附属长征医院 整形外科，电子信箱:zhangjianlin9@hotmail.com

10.3969/j.issn.1673-7040.2016.11.016

2016-09-21)