中华小猪急性心肌梗死心肌病理观察

王闯 王绍欣 董平栓 汪砚雨 王可 李转珍 魏丽娟 陈士芳 孟雅丽闫鹏 刘向勇 程建新 王丽平 段娜娜

基础研究

中华小猪急性心肌梗死心肌病理观察

王闯 王绍欣 董平栓 汪砚雨 王可 李转珍 魏丽娟 陈士芳 孟雅丽闫鹏 刘向勇 程建新 王丽平 段娜娜

目的 探讨肿瘤坏死因子-alpha（TNF-α）在中华小猪急性心肌梗死（AMI）梗死心肌中的动态表达，为AMI血运重建及心肌梗死后干预提供实验依据。方法 7头实验性中华小猪全麻后Seldinger法穿刺右侧股动脉，行冠脉造影后经微导管注入明胶海绵封堵钝缘支（OM支），建立AMI模型后，分别取第1、3、5、7、10、14、17天行免疫组化检测心肌组织中TNF-α表达情况。结果 免疫组化显示，正常猪心肌未见TNF-α表达。AMI后第3天坏死心肌中开始出现TNF-α表达，第5、7天表达逐渐升高，第10天达高峰，第14天开始下降,第17天进一步下降。结论 冠脉造影显示，明胶海绵封堵OM支后其远端血流消失，AMI模型成功建立。AMI后第10天坏死心肌中TNF-α表达最为明显，与坏死心肌的炎症及修复过程密切相关。

急性心肌梗死； 肿瘤坏死因子-alpha； 中华小猪； 动物模型

急性心肌梗死（AMI）是一种发病迅速、死亡率和致残率极高的心脏疾病，其发病与剧烈的炎症反应密切相关。肿瘤坏死因子-alpha（tumor necrosis factor alpha，TNF-α）在炎症反应中发挥关键的作用，但AMI后梗死心肌局部TNF-α的表达情况与炎症和心肌修复的关系目前国内外尚未达成共识。通过建立AMI动物模型，观察AMI后不同时期TNF-α的动态变化，有可能为解决此问题提供实验参考。中华小猪因其心脏在解剖结构、心脏血管分布等方面与人类相似，封堵其冠脉造成的缺血性心脏病发病过程与人类高度相似，一直是人类心血管疾病模型制备的优选动物。研究显示，AMI后梗死心肌周围会发生剧烈的炎症反应，炎症反应的程度会影响心肌的修复过程，对患者预后至关重要。TNF-α是一个多向性的细胞因子，对心肌缺血极度敏感，可调节心肌细胞的存活和凋亡，触发其他细胞的炎症反应。传统的研究方法以抽血观察TNF-α的动态变化居多，对于动态观察梗死心肌中TNF-α的变化过程鲜有报道。本研究使用明胶海绵封堵钝缘支建立中华小猪AMI模型，直观、连续、动态地观察AMI后梗死心肌中TNF-α的表达情况，探讨AMI后TNF-α的干预治疗与TNF-α在梗死心肌中表达情况的关系。

1 对象与方法

1.1 研究对象 中华小猪由泰州泰和生物技术有限公司提供，8只，体重13～18 kg，全部经防疫检验合格，检疫证号3205197447，许可证号SCXK（苏）2011-0002。同种同窝雄性。排除体质不良、进食不佳、近期患病的猪。

1.2 实验材料 ⑴麻醉药品：地西泮注射液（哈药集团三精制药股份有限公司）、氯胺酮（江苏恒润医药股份有限公司）、利多卡因（江苏药业集团新郑股份有限公司）。⑵造影剂：碘普罗胺（拜耳医药保健有限公司广州分公司）。⑶HE染色试剂：二甲苯（天津市永大化学试剂有限公司）、无水乙醇（天津市永大化学试剂有限公司）、甲醛（上海如吉生物科技发展有限公司）、TNF-α检测试剂盒（美国ABCAM公司，货号AB1793）。⑷血管封堵材料：明胶海绵（广州市彦达贸易有限公司）。⑸除颤仪（日本光电工业株式会社TEC-5521C）。⑹数字减影血管造影即DSA（PHLIPSMML19）。⑺心电监护仪（Philips Medizin Systeme Boebligen Gmbh German M8001A)。⑻吸痰机（鱼跃医疗TE-A）。⑼电热恒温干燥箱（天津市泰斯特仪器有限公司202-1型）、载玻片（海伦 规格：25.0 mm×7.5 mm 厚度：1～1.2 mm）及盖玻片（盐城市信泰医疗器械厂0.13～0.17 mm）。⑽包埋机（LEIKE湖北襄樊徕克电子仪器厂PPDB/21）。⑾冷台机（LEIKE湖北襄樊徕克电子仪器厂PPDB/21）及切片机（LEICA RM2235）。⑿数码电子显微镜（NIKON ECLIPSE 80i）。⒀造影介入材料：6F动脉鞘管、6FJR、微导管、指引导丝、J型导丝等（临床使用过的废旧材料，均经环氧乙烷消毒）。⒁备用药品：肝素（山东鲁抗辰欣药业有限公司）、肾上腺素（天津药业集团）、多巴胺（上海禾丰制药有限公司）、尼可刹米（天津药业集团）、阿托品（福仁药业集团信阳有限公司）、氯化钾（北京益民药业有限公司）、硝酸甘油（北京益民药业有限公司）、地塞米松针（开封制药有限公司）等。

1.3 AMI模型建立方法 小猪禁食12 h，禁水8 h，肌内注射氯胺酮10 mg/kg诱导麻醉。将实验猪清洗干净后四肢固定于特定木板上，然后放置于导管床上，以3 L/min流量给氧，胸部及四肢备皮，心电持续监护，用套管针于耳缘大静脉建立静脉通道，静脉缓慢推注1 ml安定及10 mg氯胺酮。术中小猪一直保持麻醉状态，除颤仪及吸痰机备用。

采用Seldinger法穿刺右股动脉建立动物模型。具体步骤：①碘伏常规消毒，铺无菌巾。②触及右侧股动脉搏动最强处，利多卡因局部麻醉，穿刺成功后可见鲜红色动脉血自针尾喷出，送入导引导丝，沿引导丝送入6 F动脉鞘管，随即弹丸式注入肝素1000 U。术中每30 min可追加肝素2000 U。③在J型导丝引导下将Guiding导管送入升主动脉根部，行左右冠状动脉多体位造影。心电监护示：窦性心律，160～200 次/min，血压 160/130 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa）。将Runthrough远端，微导管送入OM支近端，撤出导丝，将明胶海绵混悬液（明胶海绵溶于造影剂碘普罗胺内）经微导管推入，造影显示OM支远端血流消失，撤出微导管，监测各项生命体征及氧饱和度。④术毕，拔出6 F动脉鞘管，置入人用锁骨下静脉套管，封闭股动脉创口，肝素封管后，将其固定于术区，贴膜覆盖。实验结束后，将动物送回饲养中心，单猪饲养，避免感染。

1.4 梗死心肌病理切片的制作 分别取AMI后第 1、3、5、7、10、14、17 天小猪和对照猪整体心脏，经4%的甲醛固定后于左室侧壁分别切取4块梗死心肌及1块正常心肌，脱水，石蜡包埋，切片，脱蜡，行TNF-α免疫组化检测。TNF-α免疫组化检测一抗为小鼠抗猪单克隆抗体，二抗为通用型二抗兔抗鼠免疫组化试剂盒。①3%H2O2室温孵育10 min，以消除内源性过氧化物酶的活性。③蒸馏水冲洗，PBS浸泡5 min×3次，柠檬酸加热抗原修复。③10%正常山羊血清（PBS稀释）封闭，室温孵育10 min，弃去血清；滴加一抗工作液（稀释1∶200），37℃孵育，4℃过夜。④PBS冲洗5 min×3次。⑤滴加适量生物素标记二抗工作液，37℃孵育15 min。⑥PBS冲洗5 min×3次。⑦滴加适量的碱性磷酸酶标记的链霉卵白素工作液，37℃孵育20 min。⑧PBS冲洗5 min×3次。⑨显色剂显色（DAB显色）6 min。⑩自来水充分冲洗，复染，脱水，透明，封片，于40×倍电子数码显微镜下观察并摄片。

1.5 主要观察指标 AMI后不同天数梗死心肌中TNF-α的动态变化。

1.6 设计、实施、评估者 实验由通讯作者设计，实施由第一作者及其他作者负责，评估由河南科技大学一附院病理科、河南科技大学新区医院实验室及河南科技大学医学院生物教研室负责。

2 结果

2.1 中华小猪AMI前后冠脉造影情况 7头中华小猪均成功进行了冠脉造影术及明胶海绵封堵术。中华小猪冠脉走形与人类冠脉类似，明胶海绵封堵OM支后显示远端血流消失，AMI模型成功建立。见图1。

2.2 TNF-α的表达情况 为研究AMI后不同时期梗死心肌中TNF-α的表达情况，对中华小猪AMI后第 1、3、5、7、10、14 天的梗死心肌（图 2）免疫组化检测显示：正常未梗死心肌中未见TNF-α的表达（图2A）；AMI后第1天梗死心肌中几乎未见TNF-α的表达（图2B）；梗死后第3天开始出现TNF-α的表达（图2C）；梗死后第5、7天TNF-α的表达继续增加（图2D、E），于第10天达高峰（图2F）；梗死后第 14、17天逐渐下降（图 2G、H）。

3 讨论

TNF-α是一种具有广泛生物学效应的细胞因子，属于肿瘤坏死因子及其受体（tumor necrosis factor/receptor，TNF/TNFR）超家族的一员，与一些病理过程如急性炎症反应、自身免疫性疾病等密切相关。炎症反应在AMI中发挥关键作用，血液和心肌中TNF-α升高见于心肌梗死等疾病中。而TNF-α是炎症反应强有力的触发者，多种类型的细胞如淋巴细胞、中性粒细胞、内皮细胞、成纤维细胞和平滑肌细胞等均能产生TNF-α。心肌细胞缺血时亦能分泌TNF-α[1]，但在心肌损伤后主要由单核-巨噬细胞分泌[2]。研究发现，血液中TNF-α浓度在AMI后1 h显著升高[3]，于24 h内达高峰[4]，随后开始下降，7 d后逐渐恢复正常。

国内外研究均发现，AMI后心肌中TNF-α在梗死后数天内大量增加，引起心肌严重的炎症反应，心肌细胞凋亡、肥大，心脏重塑，最终导致射血分数减小，梗死面积扩大，心肌收缩功能障碍及致命性心律失常和心脏破裂等一系列严重并发症。AMI心肌坏死的发生发展与炎症因子密切相关。TNF-α在AMI早期血液中即有较高浓度，随后迁移至心肌高度表达，对心肌坏死的进展及修复有重要影响。但动态观察坏死心肌中TNF-α的表达，国内外鲜有报道。本研究系统观察了AMI后第1、3、5、7、10、14、17 天梗死心肌中 TNF-α 的表达情况，AMI后第1天梗死心肌中几乎未见TNF-α的表达，第3天开始出现TNF-α的表达，第5、7天继续增多，梗死后第10天表达显著增强，随后开始下降。梗死后第5～17天可见大量肉芽组织和纤维瘢痕组织，梗死区域逐渐被其完全取代，可见许多新生的毛细血管、成纤维细胞和淋巴细胞。这充分说明AMI后心肌中的炎症发生发展及动态演变过程，而TNF-α可能起到一定作用。

Sun等[5]通过结扎实验鼠左前降支冠状动脉建立心肌梗死模型的研究发现，梗死心肌局部TNF-α的升高，通过诱发过度的炎症反应、基质和胶原蛋白的降解，提高基质金属蛋白酶的活性和增加细胞凋亡，促进急性心脏破裂和慢性左心室功能障碍。有学者[6]用TNF-α杂合体转基因实验鼠培育的表达TNF-α的后代模型研究发现，转基因小鼠心肌过度表达的TNF-α引起心室扩大、射血分数降低、房性或室性心律失常，并降低实验鼠的存活率。也有学者[7]研究发现，通过堵塞大鼠左前降支冠状动脉血管，30 min内即发现心肌内有TNF-α基因和蛋白表达。以上研究均说明，TNF-α能明显促进心肌坏死的发生和发展，延缓心肌的修复进程。

研究已证实，AMI是一个急性炎症过程，那么抑制这种炎症过程能否减轻心肌细胞的炎症反应、促进心肌较快修复，是目前研究的热点问题，国内外研究者正在进行一系列的研究和探讨。Sugano等[8]通过结扎雄性大鼠左冠状动脉建立的AMI模型的研究发现，AMI后早期释放的TNF-α促进心肌损伤和诱发心肌细胞凋亡，用TNF-α拮抗剂即可溶性TNF-α1型受体（sTNFR1）表达的质粒DNA心肌内直接注射治疗，可以降低心肌中TNF-α的生物活性和减少心肌细胞凋亡。Skyschally等[9]通过用猪冠状动脉内注入微滴建立的冠状动脉微栓塞模型发现，TNF-α不仅能导致心肌舒缩功能障碍，而且延迟对心肌梗死的保护作用；用TNF-α抗体冠脉内灌注能显著减小心肌梗死面积。有学者用狗为载体研究心脏舒缩功能时发现，将含人类活性TNF-α重组体（rhTNF-α）的溶液注入成年杂种狗体内，24 h后狗心脏收缩和舒张功能明显减退[10]。Yokoyama等[11]通过使用成年猫心脏和分离的心肌细胞模型研究发现，TNF-α对成年猫的心室和分离的心肌细胞具有负性肌力作用，而清除TNF-α可以完全逆转这种作用，进一步用TNF-α抗体中和治疗，可以预防TNF-α对分离心肌细胞的负性肌力作用。

不同动物实验表明，清除或中和TNF-α均能显著减轻心肌坏死，加速修复过程。TNF-α单克隆抗体治疗可显著缩小心肌梗死面积，减少血液脂质过氧化反应产物，减弱有害的心脏重塑，抑制对急性损伤失调的免疫反应[12,13]。TNF-α转换酶介导单核-巨噬细胞中TNF-α的成熟在AMI的不良预后中发挥重要作用，而抑制TNF-α转换酶也许是减少AMI后相关细胞产生TNF-α的可能靶点[14]。探索性心肌内应用TNF-α抗体以抑制异常的免疫反应，逆转一系列不利的心脏重塑过程，不失为未来研究的重点。

AMI后抑制TNF-α所诱发的一系列不利的效应可能具有广阔的研究前景，为未来AMI患者的治疗和预后带来新的希望。但本研究样本数较少，尚需大样本的研究予以验证。

（本文图片第863页）

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Pathological observation of Chinese small porcine AMI

WANG Chuang，WANG Shao-xin，DONG Ping-shuan，et al.Department of Cardiology，The First Affiliated Hospital，Henan University of Science and Technology，Luoyang 471003，China

Objective To observe the dynamic expression of tumor necrosis factor alpha（TNF-α）in myocardial tissue in which Chinese small porcine survive different days and to provide experimental basis of revascularization and intervention after AMI.Methods The obtuse marginal（OM）branch of 8 Chinese small porcines were blocked by gelatin sponge via microcatheter under general anesthesia through Seldinger right femoral artery puncture after coronary angiography.After AMI model were established successfully，the animals were sacrificed after 1，3，5，7，10，14，17 days respectively use immunohistochemical staining to test the expression of tumor necrosis factor alpha（TNF-α）in the cardiac muscles.Results Immunohistochemistry showed there was no TNF-α in normal myocardial tissue，TNF-α was started to express in the necrotic myocardial tissue on 3 day after AMI，increased gradually on 5-7 day post-AMI，peaked on 10 day and started to decrease on 14 day，decreased further on 17 day.Conclusion Coronary angiography showed that the remote flow disappeared after the OM branches were blocked by gelatin sponge，the model of AMI was establish successfully.The necrotic myocardial tissue was repaired preliminarily and revascularization was safe relatively.The expression of TNF-α in the necrotic areas peaked on 10 day post-AMI and were associated with the inflammation and reparative processes of the necrotic cardiac muscles.

Acute myocardial infarction； Tumor necrosis factor alpha； Chinese small porcine； The model of animal

WANG Shao-xin，E-mail：WSXdoctor@163.com

洛阳市科技支撑项目资助（项目编号：1101047A）

471003 河南省洛阳市，河南科技大学第一附属医院心内科

王绍欣，E-mail：WSXdoctor@163.com

10．3969/j．issn．1672－5301．2016．09．022

Q95-33；R542.2+2

A

1672-5301（2016）09-0850-04

2016-03-02）