脑缺血再灌注损伤研究进展

侯昆 戴海龙 肖志成

综述

脑缺血再灌注损伤研究进展

侯昆 戴海龙 肖志成

脑缺血； 再灌注损伤

脑卒中是最常见的死亡原因之一，目前主要治疗方法是溶栓疗法[1-3]。然而再灌注后进一步加重了损伤。脑缺血/再灌注损伤（I/R）可以导致患者产生神经损伤和身体功能缺损或残疾[4]。脑I/R损伤的防治已成为研究热点。本文主要从脑缺血再灌注损伤机制及治疗方面进行综述。

1 脑缺血再灌注损伤机制

脑缺血再灌注损伤（cerebral ischemia-reperfu－sion injury，I/R）1960年由Jennings首先提出，是指脑缺血后脑细胞被损伤，恢复血液再灌注后，组织器官功能不仅没有得到一定程度改善，反而其缺血性损伤进一步加重的现象。缺血再灌注损伤在包括心、脑、肝、肺、肾等许多重要器官均可发生。20世纪80年代后，血栓性急性心肌梗死治疗以及一些缺血性疾病相关的溶栓实验的开展，进一步促进了人们对再灌注损伤的研究，从而使血循环重建后的再灌注性脑损伤日益受到重视。目前对脑缺血再灌注损伤的机制尚未阐明，目前认为的机制包括以下几点。

1.1 自由基 自由基（free radical）即具有一个未配对电子的原子或原子团的总称，包括氧自由基（OrR）系列（超氧阴离子、羟自由基、过羟自由基等）和脂质自由基系列（如烷基自由基、脂质过氧化物自由基等）。自由基对脑组织的损伤主要发生在缺血/再灌注期，自由基对神经元的损伤机制主要包括：①改变血管的反应性，损伤血管内皮细胞，使血管内皮细胞的完整性遭破坏，造成通透性增加、血脑屏障被破坏进而出现脑水肿。②细胞膜、细胞器膜构成中含有的不饱和脂肪酸过氧化反应，磷脂被降解而变性失活[5]。同时细胞核中的DNA会被自由基攻击造成氧化损伤，甚至细胞死亡。

1.2 神经细胞内钙离子超载 Ca2+作为细胞内一种第二信使，在代谢调节方面和膜功能稳定性方面对于维持细胞正常机能活动起重要作用，亦可介导多种病理情况下的细胞死亡。正常生理情况下，细胞膜内外存在Ca2+的离子梯度浓度差，这种情况依赖于膜通透性及胞浆内钙外排机制来维持，后一过程需消耗ATP来维持。脑缺血缺氧时，由于ATP供应不足、NMDA（N-甲基-D-门冬氨酸）受体过度兴奋介导与其耦联的Ca2+离子通道逼和被抑制、膜通透性改变等导致Ca2+泵功能降低，同时线粒体、内质网储Ca2+减少，Ca2+释放增加并积累造成胞内Ca2+浓度进一步增高。脑缺血在发生再灌注后，组织由于恢复供血，Ca2+含量在细胞内迅速增多，进一步引起细胞损伤的现象称为“钙超载”[6]。在脑缺血区，脑血管内皮细胞钙离子超载，使线粒体电子转移脱耦联，进而导致氧化磷酸化这一过程受抑制，结果ATP生成量明显减少而无氧代谢过程发生增强，加重酸中毒。因ATP生成被抑制，加重了细胞损伤而使血管内皮细胞连接间隙范围扩大，提高了血脑屏障通透性，加重了血管源性脑水肿；形成恶性循环进而引起细胞代谢、结构与功能等多方面的异常变化，神经元缺少氧气和供能不足，产生了细胞钙平衡紊乱现象，从而激活了内质网应激反应[7]，最终导致细胞凋亡。

1.3 兴奋性氨基酸 自兴奋毒性（excitotoxicity）作用的概念被Olney提出以来，一系列研究已证明，缺血再灌注造成的神经元死亡主要是由谷氨酸（glutamic acid，GA） 等兴奋性氨基酸（excitative amino，EAA）引起的。正常生理状况下，作为正常的神经递质兴奋性氨基酸，在神经元之间信息传递中发挥重要作用，谷氨酸经由突触前膜释放后通过神经细胞膜上的高亲和性摄取系统摄取被灭活。病理状态下，细胞内钙超载是一种介导兴奋性氨基酸递质参与神经毒性作用的关键因素。在脑缺血缺氧时，GA大量释放而其再摄取机制受阻，突触中GA堆集使NMDA受体（N-甲基-D-天门冬氨酸受体）过度兴奋，启动了NMDA受体的控钙通道而使外钙大量内流，引起内源Ca2+释放进而谷氨酸受体过度激活。细胞外GA和天门冬氨酸（aspartic acid，Asp）水平明显提高，邻近神经细胞膜EAAs-R被激活，随之发生神经细胞膜或胶质细胞膜的去极化，造成摄取EAAs的功能受损产生神经毒性作用，并引起神经元损伤，这就是谷氨酸的兴奋毒作用。神经毒性首先由突触后神经元胞浆内自由钙的动员介导，依次引起氧自由基的产生、能量衰竭、细胞骨架损伤、蛋白质解折叠及一些神经元发生凋亡[8]。

1.4 细胞因子、黏附分子 细胞因子（cytokines）是多种类型细胞产生的一组小分子信息蛋白，在宿主中参与防御反应、伤口愈合、全身性感染等过程，可诱导神经胶质细胞和内皮细胞的黏附因子表达，促进中性粒细胞在微血管内的黏附和聚积，并参与促进血脑屏障的改变过程。白介素-1β（IL-1β）即IL-1的亚类，是一种炎症细胞的强烈趋化因子。它能诱导和促进脑缺血后炎症介质的损伤反应，引起神经元损伤，主要功能是介导白细胞和内皮细胞的紧密黏附作用。在发生缺血时，病变组织产生的大量炎症介质参与局部血管内皮细胞和白细胞激活的过程，细胞表面黏附分子数量增多和功能明显上调，造成白细胞和内皮细胞大量牢固黏附，白细胞聚集阻塞微血管，降低脑血流[9]。此外有报道，小胶质细胞与脑缺血再灌注的炎症反应密切相关。在脑缺血后几分钟，一方面肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白介素-1β增多可导致小胶质细胞的进一步活化，当细胞发生凋亡时，会转化为巨噬细胞；另一方面，小胶质细胞激活后可产生TNF-α、IL-1β、巨噬细胞炎性蛋白-1α及巨噬细胞炎性蛋白-1β等炎症反应因子，补体如C1q、C2、C3和C4等，这些物质在中枢神经系统免疫炎症级联反应中起重要作用，可造成神经元凋亡，促进脑缺血发生、发展[10]。

1.5 细胞凋亡 脑缺血再灌注损伤的发生，作为一种复杂的病理生理过程，可诱导多种基因表达，包括促凋亡基因和抑制凋亡基因，也可能诱导神经元的凋亡，但确切的机制目前还不清楚。通过抑制凋亡发生特别是调控相关的信号通路，可一定程度阻止缺血性损伤病灶的恶性变化。在脑缺血损伤过程中，p38MAPK、Caspase家族、Fas/Fasl、Bcl-2家族、CHOP等基因可被诱导和表达发生变化，而Fas/Fasl、p38MAPK、CHOP等基因的过表达可诱导缺血后的神经元凋亡，并可能参与缺血后神经元凋亡的信号传导过程。

1.6 血脑屏障破坏 血脑屏障（Blood-Brain Barrier，BBB），作为中枢神经系统中存在于毛细血管腔与神经组织之间的所有结构，是脑组织与周围环境进行物质交换的通道，是一种脑与血液及脑脊液之间的屏障，并对脑组织内环境稳态的维持起着相对重要的作用，它的结构损伤性变化将会使脑内微环境发生一定的改变，从而引起脑神经细胞结构和功能、代谢等的改变。脑缺血时，BBB受损，血管通透性明显增加，毛细血管内水分和血浆蛋白经过膜结构发生外渗，位于细胞间隙内的水分增多，造成血管源性的脑水肿症状，从而加重脑损伤。大量研究表明，基质金属蛋白酶（matri metalloproteinases，MMPs）几乎可降解所有的细胞外基质。在动物脑缺血模型，MMP-9表达量显著增加，加强了脑毛细血管基膜的降解，导致BBB受损、脑水肿形成并可能出血转化[11]。实验显示，MMPs抑制剂可以通过抑制MMP-2和MMPO蛋白表达及其活性上调，减轻脑水肿和缩小脑梗死面积，从而表现出脑缺血/再灌注损伤的保护性作用[12]。

1.7 一氧化氮（NO）的作用 近年来的一些研究结果表明，NO这种带有自由基的氮氧化合物，以精氨酸为底物，在一氧化氮合酶（NOS）催化下产生神经保护和神经毒素双重作用。NOS同功酶有3种亚型，即nNOS、iNOS和eNOS，形成的NO有神经毒性的一般源于iNOS和nNOS的过度表达，而源于eNOS所产生的NO却有神经保护作用。研究结果表明，nNOS在缺血过程中和兴奋性神经毒性损伤的早期过程起关键作用。在脑缺血后12小时，可检测到iNOS蛋白和催化活性；缺血24小时后，在局灶性脑梗死模型中应用iNOS抑制剂能表现出缩小梗死面积的作用；在缺血48小时iNOS会到达峰值，经过7天左右才恢复至基础水平。实验证明，内皮源性NOS具有神经保护作用，神经源性NOS介导产生的一氧化氮参与缺血早期的脑损伤，具有神经毒性作用[13,14]。

2 脑缺血再灌注损伤的治疗

2.1 清除自由基 清除自由基可减少再灌注时氧基团的产生，能保护脑组织免受再灌注损害。由于再灌注治疗期十分短暂，目前主张在再灌注前或者再灌注早期即对自由基进行清除。自由基的清除主要靠自由基清除剂，包括酶性自由基清除剂如超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT）等；低分子的自由基清除剂如维生素C、维生素E和谷胱甘肽等；其他如甘露醇、糖皮质激素等。一系列清除自由基药物在临床上已被推出，如超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶、还原型谷胱甘肽氧化酶（GSH-PX）、甘露醇和激素。研究表明，急性脑梗死早期使用中等剂量的地塞米松可有效地抑制细胞膜脂质过氧化反应的进行，从而稳定细胞膜结构并减轻缺血性损伤，在应用于保护灰质结构的神经元作用中更明显。自由基学临床应用的理论解释及确切的疗效尚未明确，尚须做大量的研究工作。

2.2 抑制细胞内钙超载 细胞内Ca2+浓度升高既是脑损伤的后果，又是进一步脑损伤的始动因子。细胞内钙超载被称为“细胞死亡的最终共同途径”。针对钙超载目前使用的钙拮抗剂如双氢吡啶类的尼莫地平，以及双苯碱氨类的脑益嗪等均有较好的疗效。通过减轻钙超载引起的线粒体损伤，使神经细胞死亡通路的开启信号过程被抑制。钙离子通道拮抗剂作为一种无特异性的效应剂如SB201823和SB20684在局灶性和全脑缺血模型中具有神经保护性作用。许多L-型钙离子通道阻滞剂因血脑屏障通透性较差且有全身性心血管系统副作用，被排除了在脑缺血动物模型中成功的可能性。

2.3 抑制兴奋性氨基酸毒性作用 兴奋性氨基酸是中枢神经系统中发挥作用的主要兴奋性神经递质，包括谷氨酸、天门冬氨酸等，药物可通过抑制脑内兴奋性氨基酸受体活性而发挥作用。Gln是合成GA的重要前体，Gln对胶质细胞和神经元去极化神经毒性损伤具有调控作用。Matsushita等[15]在神经元（SC9）、胶质（WC5）和成神经细胞瘤-神经胶质瘤杂交细胞株的细胞培养研究中发现，GA依据培养基中Gln浓度的差别而具有双重作用。正常生理条件下，它在神经元信息传递过程中发挥重要作用；在病理条件下，GA/Gln比率的改变对一些神经变性疾病的发生具有重要作用。胶质细胞中富含谷氨酰胺合成酶能将GA转化为Gln，脑脊髓组织中细胞外大量的GA主要通过胶质细胞摄取，因此，胶质细胞对维持GA的自身平衡稳定具有积极的作用。基于谷氨酸在缺血再灌注损伤中重要作用，涉及谷氨酸释放的钙离通道研究为人们提供了诱人的治疗前景。Koinig等[16]证实，脑缺血给予罗吡唑预处理，能明显降低海马区神经细胞外的谷氨酸浓度，其减少脑梗死面积及减轻神经功能损伤的效果与亚低温疗法相当。

2.4 抑制过量一氧化氮生成 一氧化氮一方面通过扩张血管、改善缺血组织血供、抑制血小板聚集、减轻缺血和再灌注损伤的方式发挥作用。它又介导和参与了缺血和再灌注损伤的毒性作用。这主要与组织损伤的发生过程、NO浓度变化及产生NO的NOS类型有一定相关，如果产生过多的NO释放现象，则表现为毒性作用并加重脑缺血后的损害程度。因此，抑制脑缺血后过多NO生成如采用NO合成酶抑制剂L-NNA（NG-Nitro-L-arginine）等，是减轻脑缺血再灌注损伤的手段之一。

2.5 调节神经细胞凋亡 细胞死亡包括坏死或凋亡。这两种机制具有不同的组织学和生物化学特征。对于坏死，死亡受体的刺激（例如局部缺血）本身往往是细胞死亡的直接原因。相比之下，在细胞凋亡中死亡受体的刺激激活调控受损细胞的级联反应。不像坏死，这是一种病理过程，细胞凋亡是正常发育过程中（生理凋亡）的一部分；然而，它也发生在多种疾病（异常细胞凋亡）[17]。细胞凋亡作为一种主动的不同于细胞坏死的基因调控方式，是细胞自主有序的死亡过程。脑缺血再灌注后，能量代谢发生障碍、氧应激、钙超载，以及缺血缺氧本身都能促进凋亡的发生。而与细胞凋亡最为密切的基因有Bcl-2家族和Caspase家族。其中Bcl-2作为Bcl-2家族中的一员具有抑制凋亡的作用，其他主要是促进凋亡，因此调节这些基因即能达到调节细胞凋亡的作用。凋亡的发生信号一旦被抑制，则可一定程度上阻止缺血性损伤病灶的扩大。近年来，多数研究侧重脑缺血损伤的信号通路及相关因子。在脑缺血再灌注过程中，p38的存在有可能影响细胞损伤[18]。P38信号通路介导氧化还原应激、细胞死亡和缺血/再灌注伤[19]。Notch信号通路中，notch-1、NICD（notch intracellular domain）在脑缺血再灌注损伤中也有重要参与作用[20]。研究报道，哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信号通路也参与缺血性损伤。该通路是否可预防脑损伤中风是有争议的，它是否参与缺血后处理（IPC）对中风的保护作用尚未报道[21]。

2.6 抑制白细胞作用 白细胞特别是中性粒细胞是再灌注损伤的主要效应器细胞，能够产生机械阻塞、炎症反应失控和破坏血脑屏障的现象。脑部发生缺血-再灌注时，会使周围血液中的嗜中性粒细胞和吞噬白细胞汇集至损伤区域，经滚动附着进入梗死区域，再通过周边血液经微循环过程黏附聚集于大脑血管内皮上，加剧了脑细胞缺血，使梗死面积逐渐扩大，导致二次神经损伤。因此，抗白细胞黏附、抑制炎性因子释放是减轻脑缺血再灌注损伤的手段之一。利用IL和细胞间黏附分子（ICAM）制备单抗具有调解和保护脑细胞的作用，已知的抗黏附分子单克隆抗体、抗细胞因子抗体即是有效的手段。随着转基因及基因敲除动物模型的引入，研制这些细胞因子特异性拮抗剂的药品，将为脑血管病的预防及治疗提供新的手段。

2.7 亚低温 多年以前，人们便认识到低温对缺血脑组织有一定的保护作用。在外科手术中，常规方式是采用低温方法阻止因低循环而致的心脏、脑及其他器官的缺血性损害。近年研究表明，在神经保护方面，亚低温比深低温更有意义。亚低温早期治疗对脑缺血再灌注损伤有保护作用，能明显减轻缺血后脑损害的程度，对神经功能恢复起一定促进作用。一般认为亚低温脑保护的机制是：降低氧耗来保护血脑屏障，进而减轻脑水肿程度；一定程度抑制内源性毒性产物的生成，进而减缓损害作用；减少钙离子的内流现象，在一定程度上阻断胞内钙超载所引发的一系列有害反应；减少自由基的生成，减少脑组织结构蛋白的破坏。

3 展望

由于脑缺血再灌注机制的复杂性，人们也在探索其他可行的方法来减轻脑缺血再灌注损伤。最近的研究中锂也被认为参与了神经退行性疾病和脑血管损伤[22-24]。锂是一种著名的治疗情绪障碍的药物，有研究表明，氯化锂（LiCl）对脑血管疾病有脑保护作用[25]。在脑缺血再灌注损伤中，miRNA可能是潜在的缺血再灌注损伤的治疗目标，但其安全性和其他限制还需要进一步确认[26]。

［1］Friedlander RM.Apoptosis and caspases in neurodegenerativediseases.N Engl J Med，2003，348：1365-1375.

［2］Sheth KN，Smith EE，Grau-Sepulveda MV，et al.Drip and Ship Thrombolytic Therapy for Acute Ischemic Stroke Use，Temporal Trends，and Outcomes.Stroke，2015，46：732-739.

［3］陈晰，王思琪，李运曼.缺血性脑卒中后血栓素A2的作用及相关药物研究进展.中国心血管病研究，2015，13：117-120.

［4］Zhai X，Chen X，Shi J，et al.Lactulose ameliorates cerebral ischemia-reperfusion injury in rats by inducing hydrogen by activating Nrf2 expression.Free Radic Biol Med，2013，65：731-741.

［5］王光胜，耿德勤.脑缺血/再灌注损伤机制研究进展.医学综述，2011，17：3753-3756.

［6］Doyle KP，Simon RP，Stenzel-Poore MP.Mechanisms of ischemic brain damage.Neuropharmacology，2008，55：308-310.

［7］Hu P，Han Z，Couvillon D，et al.Autocrine tumor necrosis factor alpha links endoplasmic reticulum stress to the membrane death receptor pathway through IRE1 alpha-mediated NF-kappaB activation and down-regulation of TRAF2 expression.J Mol Cell Biol，2006，26：3071-3084.

［8］Lee JM，Zipfel GJ，Choi DW.The changing landscape of ischemic brain injury mechanisms.Nature，1999，399：A7-14.

［9］曾靖，黎晓，黄志华.脑缺血再灌注损伤与炎症反应关系.时珍国医国药，2011，22：698-700.

［10］Arumugam TV，Woodruf TM，Lathia JD，et al.Neuroprotection in stroke by complement inhibition and immunoglohulin therapy. Neuroscience，2009，158：1074-1089.

［11］Candelario-Jalil E，Yang Y，Rosenberg GA.Diverse roles of matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases in neuroinflammation and cerebral ischemial. Neuroscience，2009，158：983-994.

［12］Chen W，Hartman R，Ayer R，et al.Matrix metalloproteinases inhibition provides neuroprotection against hypoxia-ischemia in the developing brain.J Neurochem，2009，111：726-736.

［13］Zhao ZQ.Postconditioning in reperfusion injury：a status report. Cardiovase Drugs Ther，2010，24：265-279.

［14］ Jung JE，Kim GS， Chen H， etal.Reperfusion and neurovascular dysfunction in stroke：from basic mechanisms to potential strategies for neuroprotection.Mol Neurobiol，2010，41：172-179.

［15］Matsushita Y，Shima K，Nawashiro H，et al.Real-time monitoring of glutamate following fluid percussion brain injury with hypoxia in the rat.J Neurotrauma，2000，17：143-153.

［16］Koinig H，Vornik V，Rueda C，et al.Lubeluzole inhibits accumulation ofextracelularglutamate in thehippocampus during transientglobalcerebralischemia.Brain Research，2001，898：297-302.

［17］Kanduc D，Mittelman A，Serpico R，et al.Cell death：apoptosis versus necrosis.Int J Oncol，2002，21：165-170.

［18］Kovalska M，Kovalska L，Pavlikova M，et al.Intracellular Signaling MAPK Pathway After Cerebral Ischemia-Reperfusion Injury.Neurochem Res，2012，37：1568-1577.

［19］Ashraf MI，Ebner M，Wallner C，et al.A p38MAPK/MK2 signaling pathway leading to redox stress，cell death and ischemia/reperfusion injury.Cell Commun Signal，2014，12：6.

［20］Zhang HP，Sun YY，Chen XM，et al.The Neuroprotective Effects of isoflurane preconditioning in aMurinetransient Global Cerebral Ischemia Reperfusion Model：the Role of the Notch Signaling Pathway.Neuromolecular Med，2014，16：191-204.

［21］Xie R，Wang P，Cheng M，et al.Mammalian Target of Rapamycin Cell Signaling Pathway Contributes to the Protective Effects of Ischemic Postconditioning Against Stroke.Stroke，2014，45：2769-2776.

［22］Chuang DM.Neuroprotective and neurotrophic actions of the mood stabilizer lithium： can it be used to treat neurodegenerative diseases?Crit Rev Neurobiol，2004，16：83-90.

［23］Bian Q，Shi T，Chuang DM，et al.Lithium reduces ischemiainduced hippocampal CA1 damage and behavioral deficits in gerbils.Brain Res，2007，1184：270-276.

［24］Kang K，Kim YJ，Kim YH，et al.Lithium pretreatment reduces brain injury after intracerebral hemorrhage in rats.Neurol Res，2012，34：447-454.

［25］Fan M，Song C，Wang T，et al.Protective effects of lithium chloride treatment on repeated cerebral ischemia-reperfusion injury in mice.Neurol Sci，2015，36：315-321.

［26］Di Y，Lei Y，Yu F，et al.MicroRNAs Expression and Function in CerebralIschemiaReperfusion injury.JMolNeurosci，2014，53：242-250.

Research progress of cerebral ischemia reperfusion injury

Brain ischemia； Reperfusion injury

云南省高层次科技人才培引工程项目（项目编号：2011HA013）

650500 云南省昆明市，昆明医科大学分子临床医学研究院（侯昆、肖志成）；昆明医科大学附属延安医院心血管内科（戴海龙）

肖志成，E-mail：Zhicheng.Xiao@monash.edu；戴海龙，E-mail：dhlkm@qq.com

10.3969/j.issn.1672－5301.2016.01.003

R743

A

1672-5301（2016）01-0010-05

2015-08-24）