干细胞治疗脊髓损伤研究进展

梁灵刚, 吴溯帆



综 述

干细胞治疗脊髓损伤研究进展

梁灵刚, 吴溯帆

骨髓间充质干细胞； 神经干细胞； 胚胎干细胞； 人脐带血干细胞； 脂肪来源干细胞； 脊髓损伤

脊髓损伤(spinal cord injury)最常由车祸和体育运动引起，常导致肢体严重的运动和感觉功能障碍，对患者造成巨大的身心创伤，对家庭和社会也形成很大的负担。脊髓损伤目前还无有效的治疗方法，发病早期主要依赖于外科减压和激素治疗，后期只能做康复治疗。而干细胞治疗有希望成为有效的方法，已经有实验证实：干细胞移植到脊髓损伤动物模型后可存活、迁移、减轻炎症反应、释放神经营养因子、减少胶质瘢痕的形成、促进轴突再髓鞘化，从而促进损伤脊髓的再生和受损功能的恢复。笔者复习了2000-2015年干细胞治疗脊髓损伤的相关论文，对于治疗脊髓损伤的干细胞种类、移植前处理、移植方法以及其他有临床意义的内容作一综述。

1 脊髓损伤研究的干细胞种类

1.1 骨髓间充质干细胞

骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells， BMSCs)是较早应用于治疗脊髓损伤研究的干细胞，在体外试验中已经证实，这类干细胞可以被诱导分化为神经细胞和胶质细胞[1]；在体内实验中可以观察到移植细胞围绕着受体神经的轴索，起到神经胶质细胞的作用[2]；动物实验证实移植骨髓干细胞可促进受损脊髓再生，减小损伤空腔，提高神经营养因子如神经营养因子3(neurotrophic factor 3， NT-3)、脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor， BDNF)[2-3]、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)[4]的表达水平，促进轴突生长，减弱感觉过敏，促进局部血管形成，抑制胶质瘢痕形成[2]，降低局部炎症因子如IL-1β、TNF-α的表达[4]，改善肢体运动功能。

骨髓干细胞的优点是较易从骨髓中获取，并且可以取自患者自身而不涉及伦理学问题。不足之处是单次获取量有限，需要在体外培养和增殖，待达到一定数量后再进行移植；此外，这些骨髓干细胞是否能在多次传代和增殖过程中持续保持其生物学特性还有待于证实。

1.2 神经干细胞

神经干细胞(neural stem cell， NSC)是另一类用于脊髓损伤治疗研究的细胞，在体外可分化为神经元、星形细胞和胶质细胞[5]：部分体内实验也证实神经干细胞可向神经元细胞、胶质细胞[6]、星形细胞[7]和少突细胞分化。目前，有许多神经干细胞治疗脊髓损伤的研究：动物实验显示神经干细胞移植后可存活，并呈现出胶质纤维酸性蛋白和βⅢ微管蛋白(βⅢ-tubulin)染色阳性，可促使局部神经营养因子如BDNF、NT-3[8]的表达上调，凋亡蛋白酶3(caspase-3)的表达下调，这都利于局部损伤的修复。神经干细胞移植后，可见细胞和受体组织相融合，可促进轴突再生[6,9]，促进神经元轴突再髓鞘化，轴突可越过白质向灰质渗透，与宿主神经元形成突触[6]，向损伤区域外迁移，实验动物的功能得到明显改善[10]。

尽管神经干细胞移植被认为是一种有前景的治疗方法，但其长期效果有待证实。一项长达12个月的研究显示，移植的细胞至少存活了6个月，并且在这期间实验动物有功能改善，但12个月后大部分移植细胞失去了它们的形态学特征并且破裂，且功能改善在6个月之后就不再持续。在6个月时观察到大量CD8阳性T细胞渗透进脊髓组织，推测移植细胞可能激活了受体的免疫系统，移植的细胞数量减少可能是由于遭到激活的免疫系统攻击所致。早期的功能恢复是由于其分泌神经营养因子所致，移植后6～8个月细胞开始大量分化为星形细胞，分泌神经营养因子的能力减弱，功能恢复也不再继续[11]。Nemati等[12]使用猴神经干细胞移植治疗恒河猴脊髓损伤，移植细胞并未大量存活到6个月之久，但却有明显的改善肢体和尾巴运动功能的效果。在移植后第6个月可观察到实验动物有意识的肢体和尾巴运动，甚至部分动物可站立，且细胞移植治疗可明显降低实验动物肌肉萎缩和褥疮的发生率。

神经干细胞是神经细胞和胶质细胞的前体细胞，理论上讲更容易向神经细胞分化，更容易调控其分化过程，这是它在治疗脊髓损伤方面的优势。但是，由于神经干细胞需要取材于脑组织和脊髓，人的神经干细胞来源于流产胎儿，涉及到伦理学问题，其临床实际应用的可能性很小。

1.3 胚胎干细胞

胚胎干细胞(embryonic stem cells， ESC)为多能干细胞，具有高度的增殖分化能力，可分化为内胚层、中胚层、外胚层组织，由于其具有分化为几乎所有细胞的能力，也被用于治疗脊髓损伤的研究。目前的一些动物实验结果显示，移植胚胎干细胞可减弱局部炎症反应[13]，表达基质金属蛋白酶9，从而酶解胶质瘢痕的成分之一硫酸软骨素多糖，抑制胶质瘢痕的形成[14]，改善运动功能[13]。还有研究显示，移植细胞存活且在移植后7 d内，新生的轴突以大于1 mm/d的速度向瘢痕内生长，此轴突更倾向于在白质内再生[14]。

胚胎干细胞需取自胚胎组织，这将涉及伦理学问题，临床实际应用会受到很大的限制。胚胎干细胞在实际应用时如何调控其分化、避免肿瘤发生等，将是研究的难点和重点。

1.4 人脐带血干细胞

人脐带血干细胞(human umbilical cord blood mesenchymal stem cells， hUCBSCs)是在胎儿分娩时从脐带血中获得，是具有实际临床应用价值的干细胞来源，目前世界上多个国家已建立脐带血库。hUCBSCs可分化为骨、软骨、脂肪、骨骼肌、心肌、神经元等,与其他成体干细胞相比，在体外有更快的增殖速度和更小的免疫原性[15]。其在治疗血液系统疾病、免疫性疾病中的益处已被证明[16]。hUCBSCs在治疗脊髓损伤方面的作用也被逐渐认识，如可通过表达神经营养因子，改善微环境，从而有利于神经修复[15]；实验中观察到移植的细胞向远处小距离迁移，受体胶质细胞可向移植物内迁移，髓鞘化的轴突可向移植物内生长[16]，脐带血干细胞移植可明显促进动物的肢体运动功能恢复，提高动物对于刺激的反应性[17]。

脐带血干细胞来源于新生儿的脐带血，因其来源有限，限制了其应用，但脐带血库的建立在一定程度上缓和了这个问题。此外，脐带血的应用也存在着一定程度的伦理学问题。

1.5 脂肪来源干细胞

脂肪来源干细胞(adipose-derived stem cells, ADSCs)是从抽脂患者的脂肪液中分离获得，可分化为骨、软骨、脂肪等组织细胞[18]。一些研究显示了其在多个学科疾病治疗上的作用：在自身免疫性疾病的治疗上可减少破骨细胞形成、促进免疫耐受、减轻炎症反应，从而减弱类风湿性关节炎动物模型的局部和全身性的骨组织丢失[19]；还可改善血管活性，如ADSCs注射可提高缺血-再灌注游离皮瓣的存活率[20]以及加强急性心肌梗死动物模型的心肌再灌注[21]；甚至还可在体外促进毛发合成细胞的增殖及促进体内毛发的生长[22]。ADSCs也应用在脊髓损伤的研究：体外预先神经性分化的ADSCs局部移植可较好地存活并参与到神经修复中[23]；预分化的ADSCs可在脊髓组织内存活，紧密地和脊髓组织融合并且较好地包绕神经元轴突和少突细胞[18]；用ADSCs预分化的雪旺细胞移植，可促进轴突再生和再髓鞘化，运动功能有明显的改善，感觉功能恢复到正常水平[24]。

ADSCs用于脊髓损伤方面的研究还不多，但由于其提取方便、来源充足、可一次大量获取，不需体外增殖便可移植，使用自身的ADSCs不涉及伦理学问题，这使得其与其他细胞相比有较大的实际应用优势，是一种有前景的干细胞类型。

2 干细胞移植前的预处理

2.1 细胞移植前转染神经营养因子

有许多研究者做了移植前的细胞转染，试图在细胞内转染有利于神经生长的因子，其中使用最多的是各种神经营养因子(如NT-3、VEGF、FGF、 BDNF等)。神经营养因子可促进神经细胞存活和轴突生长。

2.1.1 NT-3 NT-3是众多神经营养因子的一员，可促进神经组织的修复，有学者证实，经转染表达NT-3的骨髓干细胞较普通干细胞疗效更明显，能更明显减小受损区域空腔，更好地提高动物运动功能的恢复[3]，提高NT-3、BDNF、VEGF的表达水平，减少硫酸软骨素多糖的表达[3]。Wang等[24]的研究则显示,联合移植中表达NT-3的雪旺细胞(NT-3-SCs)和表达Trkc(NT-3受体)的神经干细胞(Trk-NSCs)，可促进神经干细胞的分化、再髓鞘化和和突触形成。

2.1.2 VEGF 脊髓损伤后的低氧环境限制了干细胞移植后的存活率，血管内皮生长因子(VEGF)可促进血管生成、有神经保护作用，转染表达VEGF的干细胞移植是有前景的治疗方法，但不受控制的VEGF表达也可导致肿瘤的形成。为解决此问题有学者将转染VEGF的神经干细胞在低氧环境下预培养形成VEGF表达稳定的细胞系，再移植治疗鼠的脊髓损伤模型，结果显示移植细胞存活率增加并促进血管形成，且没有引起异常的细胞增殖和血管形成[25]。而将骨髓间充质干细胞转染表达Shh基因可提高FGF、VEGF的表达、改善局部微环境，从而提高移植细胞的存活率[26]。

2.1.3 成纤维生长因子 成纤维生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)可促进细胞有丝分裂和增殖，在脊髓损伤后促进轴突再生和修复方面重要作用。利用转染bFGF的骨髓干细胞治疗动物脊髓损伤，可更好地促进轴突再生和运动功能恢复，增加受损局部NF-200和髓鞘碱性蛋白阳性神经细胞的密度。干细胞移植受限于它的低存活率、增殖能力和促进功能恢复的能力，有学者将FGF-2置于聚丙交酯纳米微球，发现在体外培养时释放的FGF-2可以促进干细胞的增殖，将它们共同植入受损脊髓局部可提高细胞的存活率并促进运动功能的恢复[27]。

2.1.4 BDNF 脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)也是一种常见的神经营养因子，将转染BDNF的骨髓间充质干细胞移植治疗鼠的脊髓挫伤，可大大提升BDNF的表达水平，富含血小板血浆和BDNF-BMSC联合治疗可明显增加实验动物后肢运动BBB评分[28]。2.1.5 其他因子 睫状神经营养因子(ciliary neurotrophic factor, CNTF)为众多神经营养因子的一种，可以在体外环境中促进少突细胞前体细胞的分化和成熟，还可以促进成熟少突细胞的存活。将移植转染CNTF的骨髓间充质干细胞移植到鼠的脊髓损伤模型，实验动物后肢运动功能的恢复明显高于单独治疗组[29]。Nishimura等[30]研究显示，移植转染表达干扰素β的神经干细胞可通过激活TLR4(toll-like receptor 4)信号通路调控活性星形细胞,从而减少胶质瘢痕的形成，并且促进运动功能的恢复。Lin等[31]则发现，MSC移植前转染表达Ngb基因可较单独细胞移植更好地提高动物肢体运动BBB评分，且更好地降低受损局部的脂质过氧化物水平。

2.2 细胞移植前预分化

干细胞移植到脊髓损伤的动物模型后，难以直接分化为神经细胞和胶质细胞，所以有学者尝试在移植前先将干细胞诱导分化为神经系统的细胞，再植入动物模型。有研究使用猪的胚胎干细胞，在体外向神经细胞系分化，而后移植治疗鼠的脊髓损伤，结果显示移植前预分化有助于提高胚胎干细胞的治疗效果[32]。Alexanian等[33]的研究显示，骨髓干细胞在体外预先向神经细胞分化后再移植，可提高移植后细胞的存活率和分化率，更好地改善运动功能、减小空腔大小和白质丢失。将ADSCs在体外预先向神经细胞系分化2周后移植，也可更好地修复受损脊髓[23]，细胞存活更好、与宿主组织相容性更好、包绕宿主轴突和少突细胞[18]。还有研究将多能干细胞在NBR混合物(包含NGF、BDNF、RA)中培养7 d，然后添加细胞外基质蛋白TN-C进行培养，再移植治疗鼠脊髓损伤，结果显示有明显的脊髓组织再生和干细胞分布，且运动功能明显提高[34]。

2.3 其他移植前处理

使用血小板溶解物可促进神经干细胞的体外存活率[33]，移植前低氧预处理可提高经干细胞的存活率，使凋亡基因Bax的表达下降[35]，Bambakidis等[36]发现,用Shh信号通路激动剂Ag11.1可促进内源性神经前体细胞和少突前体细胞的增殖，而使用丙戊酸预处理BMSC则可促进趋化因子SDF-1的受体CXCR4表达上调，从而促进移植的骨髓干细胞迁移到受损区域[37]。骨髓干细胞和神经细胞团块共培养，可促进神经团块分化，且它们的轴突延长并相互连接[38]。另有研究认为,髓干细胞和神经干细胞体外共培养时前者可分泌一种未知的因子促进后者向少突细胞分化，而在体内实验时并未发现此现象[39]。骨髓间充质干细胞移植联合电针刺激可较好地促进干细胞的存活和神经性分化、轴突的再生以及运动功能恢复,重建神经网络结构和功能[40-41]。

3 细胞移植方法

3.1 局部注射

局部注射为动物实验中较为常用的一种方法，许多学者采用注射器将细胞缓慢注射至受损脊髓局部中心[35]。这种方法创伤较大，需要通过手术打开脊椎骨，显露脊髓，使用针头直接将细胞注射于损伤部位，可能加重损伤或造成脊髓新的损伤，且难以重复操作。这种方法需要切开脊椎骨显露脊髓，其实际临床的可用性较小。

3.2 静脉注射

老鼠作为实验动物时，许多研究采用尾静脉注射的方法进行移植[37-38]。该方法如果应用于临床，细胞数量至少需要1×107～1×108个，且静脉给药要求较高，为实际应用带来困难。

3.3 脑脊液注射

脑脊液是在蛛网膜下腔中流动的液体，脑室和脊髓内的脑脊液相通，注入脑脊液中的干细胞可以通过脑脊液流动迁移到损伤部位。动物实验时可通过脑室内注射干细胞，在人体试验时，有研究者使用注射器将细胞在腰椎处注射入蛛网膜下腔进行移植[3,39]。对于临床应用而言，这种方法最具有实际操作意义。

3.4 种植于生物材料内

对于切开脊髓的有缺损的动物模型，有研究者将细胞提前种植于生物材料如明胶海绵[24-25]、胶原支架[42]、水凝胶支架[43]上，再将生物材料移植于缺损中心，对于完全离断伤，不失为一种好的方法，移植的生物材料既可为细胞提供一个载体又可为损伤两端提供桥接作用。脊髓损伤的临床病例中，罕有需要植入材料的脊髓节段性缺损病例，其实际应用性不大。

4 人干细胞治疗人脊髓损伤

目前世界范围内干细胞移植治疗脊髓损伤主要在动物模型上进行，而最终目的在于将此项治疗手段用于人体。但由于目前细胞治疗脊髓损伤还有诸多问题亟待解决，所以世界范围内此类临床试验甚少。有研究利用自体骨髓干细胞+自体雪旺细胞移植治疗脊髓损伤，虽未观察到患者明显的功能改善，但在2年的随访时间里未观察到肿瘤等不良事件发生，作者认为细胞移植是安全的[44]。Karamouzian等[45]研究显示，通过腰椎穿刺移植骨髓干细胞虽然并未得到明显的益处，但并未发生明显不良后果，作者认为其是安全的。Saito等[46]通过腰椎穿刺移植自体骨髓干细胞治疗1例C5损伤的患者，在6个月的随访时间内发现患者有轻微的运动功能改善而无感觉功能改善，后又继续进行6个月的随访，发现患者可以自主坐立于轮椅。另一项利用自体骨髓干细胞移植治疗脊髓损伤20例的临床试验结果显示，ASIA 1级改善1例，2级改善1例，其余大部分患者的身体异常束带感和头痛症状得到改善[47]。

脊髓损伤是一种后果严重但缺乏有效治疗手段的疾病，干细胞的研究给这一顽症带来了希望的曙光，仍有大量的工作需要我们去做。

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310014 浙江 杭州,浙江省人民医院 整形外科

梁灵刚(1989-)，男，四川南充人，硕士研究生.

吴溯帆，310014，浙江省人民医院 整形外科，电子信箱：sufanwu@163.com

10.3969/j.issn.1673-7040.2016.10.019

2016-06-19)