猪源性成分检测中3种DNA提取方法比较

猪源性成分检测中3种DNA提取方法比较

王萍,乔勇升,韩芷玲

(江苏省泰州市食品药品检验所，江苏泰州225300)

摘要：为了达到对动物源性成分快速、准确的检定，对提取动物源性基因组DNA的方法进行了比较分析。考察酚-三氯甲烷法、聚乙烯吡咯烷酮法(PVP法)和试剂盒法这3种方法对DNA提取的浓度、纯度及实时荧光PCR扩增效果的影响。结果表明：酚-三氯甲烷法提取DNA浓度最高，试剂盒法纯度最高且实时荧光PCR扩增效果最好，但PVP法操作简单、安全、经济，提取的DNA用于实时荧光PCR扩增检出限可达1.98 pg/μL。使用PVP法对市场上10份不同类型的动物性产品进行了检测，检出两份产品中含有猪源性成分。PVP法应是3种方法中的首选方法，本文为实验室选择合适的DNA提取方法提供了依据。

关键词：猪源性；DNA提取；酚-三氯甲烷法；PVP法；试剂盒法；实时荧光PCR

doi:10.3969/j.issn.1672-3678.2015.06.011

收稿日期：2015-03-24

作者简介：王萍(1983—)，女，江苏泰州人，工程师，硕士，研究方向：食品检测，E-mail:wingping02091111@126.com

中图分类号：TS207.3

文献标志码：A

文章编号：1672-3678(2015)06-0061-04

Abstract：In order to detect animal-derived material rapidly and accurately,we compared and analyzed the DNA extraction methods from the animal-derived material. We investigated the effect of three methods (phenol-chloroform method,polyvinylpyrrolidone method(PVP method) and reagent kit method) on the concentration of the extracted DNA,the purity of the extracted DNA and the result of the real-time fluorescent PCR amplification. The DNA concentration of the phenol-chloroform DNA extraction method was the highest,the purity of reagent kit was the highest and the effect of the real-time fluorescent PCR amplification was the best,but the PVP method was convenient,safe and economical,the detection limit of the real-time fluorescent PCR amplification was 1.98 pg/μL. Ten different types of animal products in the market were tested with PVP method,two products were detected to contain the porcine-derived material. The PVP method should be the preferred of the three methods. The assay provided a basis for the laboratory to choose a suitable DNA extraction method.

Keywords：porcine-derived; DNA extraction; phenol-chloroform method; PVP method; reagent kit method; real-time fluorescent PCR

Comparison of three DNA extraction methods in detection of porcine-derived material

WANG Ping,QIAO Yongsheng,HAN Zhiling

(Jiangsu Taizhou Institute for Food and Drug Control,Taizhou 225300,China)

食品安全关系着人类身体健康，是全社会关注的热点问题。近年来肉制品掺假屡禁不止，肉制品以次充好，引起人们对食品安全的恐慌，这就要求食品监管部门能够对动物源性成分进行快速、准确的检验和鉴定。

用于动物源性成分的鉴定主要有物理、化学、免疫学和分子生物学等方法。其中，以检测DNA为基础的实时荧光定量PCR技术具有特异性强、灵敏度高、定量准确、自动化程度高等优点，被广泛用于分子生物学和医学研究等领域。DNA模板质量对荧光定量PCR很关键，在提取过程中若是处理不当，残留的一些有机物以及其他一些杂物就会抑制PCR的进行，从而造成假阴性，影响后续操作的进行；此外不同实验材料的组分差异，不同方法所提取的DNA质量也不尽相同，对后续的实验结果也存在差异[3-4]。提取基因组DNA的方法有很多：酚-三氯甲烷法是实验室常用的经典DNA提取方法，商业化的基因组DNA提取试剂盒目前也被实验室广泛使用，而聚乙烯吡咯烷酮(PVP)在提取植物基因组DNA方面报道的较多[5-8]，在提取动物基因组DNA方面报道的较少。

本文以猪肉为实验材料，考察这3种提取动物源性基因组DNA方法，以期从中筛选出一种简单、快速、更适合于实时荧光PCR扩增检测动物源性基因组DNA的提取方法，从而为实验室提供方法依据。

1材料与方法

1.1　材料

猪肉以及10份不同类型的其他动物性材料(蜜汁牛肉、牛肉丸 、牛肉切片、牛肉卷、牛柳、羊肉卷、羊肚、羊肉切片、羊排、羊腿)购自农贸市场或超市。所有材料买回后剪碎，装入样品袋，置于-20 ℃冰箱中备用。

1.2　主要试剂与仪器

TaKaRa DNA 提取试剂盒及实时荧光PCR猪源性DNA检测试剂盒，宝生物工程(大连)有限公司；抽提缓冲液(pH8.0)，Tris 0.05 mol/L，Na2EDTA 0.05 mol/L，SDS 30 g/L，使用HCl或KOH调节pH；提取缓冲液(pH 8.0)，Tris 0.2 mol/L，NaCl 0.25 mol/L，Na2EDTA 0.025 mol/L，SDS 50 g/L，使用HCl或KOH调节pH。

7500型荧光定量PCR仪，美国ABI公司；Lambda 35型紫外-可见光分光光度计，美国PE公司；SORVall D-37520型高速冷冻离心机，美国Thermo fisher公司。

1.3　3种DNA提取方法

采用酚-三氯甲烷法、PVP法、试剂盒法[10]3种方法对试验材料进行DNA提取。不同方法所用样品量均为0.25 g，放入经-20℃冰箱预冷24 h的研钵中，快速用力研磨粉碎后分装于编号的2 mL离心管中，每种方法重复3次。

1.3.1酚-三氯甲烷法

分别称取0.25 g粉碎的猪肉置于编号为F1、F2、F3的离心管中，具体操作参照文献，其中RNA酶消化这一步省略。

1.3.2PVP法

分别称取0.25 g粉碎的猪肉置于编号为P1、P2、P3的离心管中,加入1 mL提取缓冲液，65 ℃搅拌1 h，室温下冷却后将60 mg PVP粉末和0.5×体积的乙酸氨(7.5 mol/L)溶液与上清液混合，冰浴30 min；10 000g离心10 min，取上清液至另一离心管中，加入等体积的三氯甲烷和异戊醇(24∶1)混匀，12 000g离心5 min，抽提1次；将上清与等体积的异丙醇混合，-20 ℃放置30 min。4 ℃条件下10 000g离心10 min，弃上清液，70%乙醇溶液洗涤沉淀2次，干燥后溶于100 μL灭菌双蒸水中，4 ℃保存备用。

1.3.3试剂盒法

分别称取0.25 g粉碎的猪肉置于编号为SH1、SH2、SH3的离心管中，具体操作见试剂盒说明书。

1.4　DNA质量检测

取20 μL DNA样品，加1 980 μL双蒸水稀释，充分混匀后，以双蒸水做空白对照[11]，用紫外-分光光度计分别测定核酸在260、280和230 nm处OD值，OD260/OD280代表DNA的纯度，OD260/OD280比值在1.8左右，表明DNA纯度高，低表明有杂蛋白质及苯酚[12]，高则表明有RNA；OD260/OD230比值通常大于2，低则可能有核苷酸、氨基酸、盐等小分子物质残留。DNA浓度计算按照式ρ=OD260×稀释倍数×50计算。

1.5　实时荧光PCR扩增检测

3种方法所提DNA稀释至10 μg/mL作为扩增模板，使用ABI 7500荧光定量PCR仪扩增，PCR反应体系为25 μL，各成分组成：ddH2O 9.5 μL，2×Premix for Porcine 12.5 μL，Primer Mix for Porcine 1 μL，Probe Mix for Porcine 1 μL，DNA模板1 μL；PCR反应程序：95 ℃，10 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40个循环，60 ℃延伸时收集荧光信号。检测试剂盒是采用双标记荧光(FAM、HEX)在同一反应管内对猪COX I基因及内参照反应同时进行扩增，若FAM荧光检出，且Ct值(每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数)≤35则视为检出猪源性成分，若Ct值>35，则视为未检出猪源性成分。

1.6　灵敏度检测

提取的DNA模板用无菌双蒸水10倍梯度稀释，进行实时荧光PCR反应，检测所提DNA的扩增检测限。

2结果与讨论

2.1　3种方法提取的DNA质量比较

PCR扩增对模板DNA的质量要求较高，3种DNA提取方法在原方法上稍加改进：首先用-20 ℃预冷的研钵研磨代替了-196 ℃的液氮研磨，操作上更加安全；酚-三氯甲烷法省去了RNA酶进行RNA消化的过程，PVP法通过反复试验发现需要增加1次三氯甲烷：异戊醇抽提才能去除蛋白质，可能跟所选材料动物性制品中脂肪和蛋白质较多有关系。从表1中可以看出酚-三氯甲烷法提取的DNA浓度最高，PVP法提取的次之，试剂盒法提取的最低；但试剂盒法提取的DNA纯度最高，酚-三氯甲烷法提取的DNA中含有一些RNA，PVP法提取的DNA中则有一些残留的蛋白质，3种方法提取的DNA中都有一些盐等小分子物质残留。

2.2　3种方法提取的DNA实时荧光PCR扩增效果

3种方法提取的猪源性基因组DNA在相同质量浓度(10 μg/mL)和条件下进行实时荧光PCR扩增反应，Ct值见表2。HEX和FAM荧光信号均被检出，且FAM的Ct值在19.018～20.648之间，说明3种方法提取的DNA在同浓度及同条件下扩增效果相差不大，并且都可直接用于实时荧光PCR扩增检测，都能满足后续分子生物学的需要。其中试剂盒法的FAM荧光信号的Ct值最小，扩增效果最好；酚-三氯甲烷法次之；PVP法的Ct值最高。由此，也进一步说明了DNA模板的质量影响着荧光定量PCR反应的进行。

表1　3种方法提取猪源性基因组DNA质量比较

表2　3种方法提取猪源性基因组DNA用于实时荧光PCR扩增的 C t值

2.3　以PVP法提取的DNA为模板的检出限试验

将PVP法提取的质量浓度为198 μg/mL的DNA作为模板，10倍梯度稀释后实时荧光PCR扩增检测，各梯度反应体系中的模板量分别为19.8、1.98、0.198、0.019 8和0.001 98 ng/μL，扩增曲线见图1。由图1可知，实时荧光PCR可检出1.98 pg/μL的DNA样品。这说明PVP法提取的DNA用于实时荧光PCR检测灵敏度可达到皮克级。

图1　 PVP法提取的DNA为模板的检出限试验 Fig.1　 Detection limit test using DNA extracted with PVP method as template

2.4　市售动物性产品的猪源性成分检测

随机选取市场上10份不同类型的动物性制品作为样品，用PVP法提取DNA进行实时荧光PCR扩增检测猪源性成分，其中蜜汁牛肉和牛肉卷2份样品检出为阳性，Ct值分别为17.222和20.401(均<35)，扩增曲线见图2。由图2可见，这2份样品都掺入了猪肉欺骗消费者，2份阳性样品的检出也说明了PVP方法也适合于其他动物性样品的基因组DNA提取。

图2　 PVP法检测市售动物性产品的猪源性成分 Fig.2　 Detection of porcine-derived material in animal products from the market with PVP method

3结论

3种方法所提DNA都可直接用于实时荧光PCR扩增，其中酚-三氯甲烷法所提DNA浓度较高，但是该方法在操作上比较繁琐，提取时间长，有机溶剂抽提次数多，对人体有一定的伤害；试剂盒法所提DNA纯度较高，提取时间最短，但是所得DNA量较少，且

试剂盒本身价格也较昂贵；PVP法操作过程相对简单，有机溶剂用得少，虽然实时荧光PCR扩增检测Ct值是最高的，但是其DNA模板经过稀释，灵敏度可达到皮克级，完全满足分子生物学的需求。

综上所述，PVP方法操作简单、安全、经济、实时，荧光PCR扩增效果好，可以检出市售动物性肉制品中的猪源性成分，是3种方法中的首选方法。

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(责任编辑荀志金)