猪STIM1基因变异筛选及其与产仔数性状的关联分析

吴俊静　董斌科　乔木　彭先文　武华玉　雷彬　梅书棋

摘要：猪的产仔数是繁殖性状中重要的经济性状。STIM1是一种钙离子结合蛋白，在卵母细胞成熟、受精以及胚胎早期发育过程中发挥重要作用。鉴定获得了猪STIM1基因内含子10中的1个新的突变位点g.199893-delT，采用直接测序法在DIV系和大白猪群体中进行了基因分型，并对产仔数性状进行了关联分析，结果发现该突变显著影响母猪的产仔数性状（P<0.05）。NN基因型母猪总胎次的产仔数和产活仔数显著高于MM基因型（P<0.05）。

关键词：猪；产仔数；STIM1基因；关联分析

中图分类号：S828；S813 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）24-6296-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.24.051

Abstract： In pig production， litter size has been one of the most important economical traits.Stromal interaction molecule 1 （STIM1） was a transmembrane-spanning Ca2+-binding protein which was essential in oocytes maturation and fertilization， and early embryo development. In this study a novel mutation （g.199893-delT） at intron 10 in porcine STIM1 gene were identified by sequencing. Association results showed that it significantly affected the litter size traits in both DVI line and Large White pigs （P<0.05）. In all parities， the sows with NN genotype had significantly more piglets than that of MM genotype （P<0.05）.

Key words：pig； litter size；STIM1 gene；association analysis

猪的产仔数是繁殖性状中重要的经济性状，直接关系到养猪业的经济收益。提高猪产仔数对提高养猪业的总体经济效益意义重大。据统计，在中国如果母猪产仔数每胎增加1头，每年将增收190亿元的纯利[1]。母猪产仔数性状是一个由排卵、受精、着床、胎儿发育等多个具有时间顺序特征的组分性状构成的复合性状，属于遗传力很低（0.1左右）的数量性状，难以用常规育种技术进行遗传改良，所以寻找控制猪繁殖率的主效基因及其遗传标记对提高母猪产仔数具有重要意义。

STIM1（Stromal interaction molecule 1）基因参与调节胞内Ca2+浓度，在哺乳动物卵母细胞中表达，可能参与调节卵母细胞成熟和受精过程。STIM1蛋白能感受内质网内钙库Ca2+浓度，从而调节Ca2+内流，参与形成Ca2+释放激活Ca2+通道（CRAC），引发钙库控制的Ca2+内流（SOCE），调控膜内外的Ca2+浓度，与钙振荡相关[2-4]。而卵母细胞的减数分裂激活和成熟以及受精过程均受到钙振荡的调节[5，6]。2009年，Koh等[7]首次报道STIM1存在于哺乳动物卵母细胞中，并且在猪卵母细胞中STIM1能探测内质网Ca2+浓度，并触发SOCE。2012年最新研究表明，STIM1在鼠成熟卵母细胞中的表达量远高于未成熟卵母细胞，且仅在成熟卵母细胞中才能检测到SOCE[8]。精子刺激后，STIM1在小鼠卵母细胞中迅速迁移，并参与受精过程钙振荡的维持[9]。在秀丽新小杆线虫中发现，STIM1干扰后导致生殖腺形态异常，无法正常排卵，也无法受精[10]，STIM1是秀丽新小杆线虫正常排卵和繁殖力所必需的[11]。另外，大量研究报道STIM1对肿瘤有抑制作用，如子宫颈癌[12]、乳腺癌[13]、卵巢癌[14]等。

综上所述，STIM1基因与动物繁殖性能有着密切联系，参与调控卵母细胞成熟及受精过程。目前猪STIM1基因对母猪产仔数的影响还未见报道，本研究筛选鉴定猪STIM1基因多态位点，并与产仔数性状进行关联分析，以期获得母猪产仔数相关的新分子标记。

1 材料与方法

1.1 试验样品

采集了24头梅山猪（湖北省英山县绿源养猪专业合作社）、174头大白猪（湖北省农业科学院畜牧兽医研究所原种猪场）、107头DIV系猪（华中农业大学实验猪场）共305头母猪血样，并收集其2005-2010年期间的繁殖性状记录，主要包括总产仔数（Total number born，TNB）和产活仔数（Number born alive，NBA）。

基因组DNA采用苯酚/氯仿提取法提取。

1.2 猪STIM1基因多态性检测

根据猪STIM1基因的基因组序列（GenBank登陆号：NC_010451.3）设计引物：上游引物：5′-GCCTTGCCATCCCCTTGA-3′，下游引物：5′-AGAGACCGCCGATACCCC-3′。在大白猪、梅山猪和DIV系猪中，每个品种猪5个样本混合，进行PCR扩增。PCR反应体系50 μL，反应体系组成： DNA模板2 μL，10×buffer（含Mg2+） 10 μL，上、下游引物各2 μL、dNTPs 8 μL、TaqDNA聚合酶1 μL，无菌双蒸水25 μL。PCR的反应程序为：95 ℃预热4 min；95 ℃变性30 s，64～54 ℃退火30 s（每个循环降低0.5 ℃），72 ℃延伸40 s，共20个循环；95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，共15个循环；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测后，采用Gel Extraction Kit试剂盒进行纯化。纯化产物直接送到北京奥科鼎盛生物科技有限公司进行测序，对比筛选基因多态性。

1.3 基因分析

利用上述引物，采用上述直接测序法在大白猪和DIV系猪群中进行基因分型。

1.4 统计分析

采用SAS 9.0软件的GLM模型进行标记的关联分析。所采用模型为：Yijk=μ+Pi+Sj+Gk+eijk，其中Yijk为性状表型值，μ为总体均值，Pi为胎次效应，Sj为季节效应，Gk为基因型效应，eijk为随机误差。

2 结果与分析

2.1 猪STIM1基因多态性检测结果

通过混合样本测序的方法，检测到猪STIM1基因的1个新突变位点，即位于该基因199 893 bp处的1个T碱基的插入/缺失突变g.199893-delT，并在各猪群中均检测到3种基因型NN、MN和MM，各基因型测序图见图1。

在梅山猪、大白猪和DIV系猪3个群体中检测了该突变位点的等位基因及基因型频率分布情况，结果见表1。在大白猪、DIV系、梅山猪3个群体中检测了猪STIM1基因两种等位基因的分布频率，结果见表1。由表1可见，N等位基因频率在大白猪中较低，仅为19.0%，在DIV系中为40.2%，在梅山猪中最高，达56.3%。

2.2 关联分析

在大白猪和DIV系猪群体中分析了猪STIM1基因突变位点基因型与母猪产仔数性状的相关性，结果（表2）发现该突变显著影响母猪产仔数性状。在两个猪群中，NN基因型母猪总胎次总产仔数均极显著高于MM基因型母猪（P<0.01），且存在总产仔数NN>MN>MM的趋势。在DIV系中，NN基因型个体的总胎次产活仔数显著高于MM和MN基因型个体（P<0.05）；在大白猪群中，NN基因型个体的总胎次产活仔数极显著高于MM基因型个体（P<0.01），MN基因型个体的的总胎次产活仔数与其他两种基因型间无显著差异。

3 小结与讨论

本研究鉴定获得了猪STIM1基因的1个新的插入缺失位点g.199893-delT，该位点位于内含子10中。在大白猪、DIV系、梅山猪三个群体中检测了猪STIM1基因两种等位基因的分布频率，发现N等位基因频率在大白猪中较低，而在梅山猪中最高。这3个群体中，大白猪、DIV系和梅山猪平均每胎产仔数分别为（10.99±1.95）、（11.67±1.77）和（15.21±3.14）头。由此可见，产仔数越高的群体，N等位基因频率越高。在大白猪和DVI系猪群中进行了猪STIM1基因突变位点g.199893-delT多态性与母猪产仔数性状的关联分析，结果发现，该位点显著影响母猪的产仔数和产活仔数。携带N等位基因的母猪产仔数较高，N等位基因有利于提高母猪产仔数性状。该位点可作为分子标记用于选育母猪产仔数性状。

在母猪卵母细胞中，STIM1参与调节钙离子信号，是产生持续性钙离子振荡所必需的因子，其影响卵母细胞的成熟、受精以及随后的早期胚胎发育过程[7，15]。本研究发现猪STIM1基因的这两个突变位点可能影响了该基因的转录或表达，从而影响母猪卵母细胞的成熟、受精以及早期胚胎的发育，导致产仔数性状的差异。其具体作用机制还需要做更深入的基因功能方面的研究。

参考文献：

[1] 王莉兴，鲁绍雄.猪产仔数相关候选基因的研究进展[J].上海畜牧兽医通讯，2008（4）：11-14.

[2] STRANGE K，YAN X，LORIN-NEBEL C，et al. Physiological roles of STIM1 and Orai1 homologs and CRAC channels in the genetic model organism Caenorhabditis elegans[J].Cell Calcium，2007，42（2）：193-203.

[3] 陈晓芳，李丛鑫，王鹏业，等.钙释放激活钙离子通道的发现及研究现状[J].河南师范大学学报（自然科学版），2009，37（6）：103-107.

[4] 高尚邦，李臣鸿.钙释放激活钙通道研究进展[J].现代生物医学进展，2009（9）：350-354.

[5] 李 妍，侯丽辉，吴效科. 钙离子在卵母细胞成熟过程中的作用[J]. 国外医学：计划生育.生殖健康分册，2007，26（4）：188-191.

[6] AJDUK A，MALAGOCKI A，MALESZEWSKI M. Cytoplasmic maturation of mammalianoocytes： development of a mechanism responsible for sperm-induced Ca2+ oscillations[J].Reprod Biol， 2008， 8（1）： 3-22.

[7] KOH S， LEE K， WANG C， et al. STIM1 regulates store-operated Ca2+ entry in oocytes[J]. Dev Biol，2009，330（2）：368-376.

[8] GOMEZ-FERNANDEZ C， LOPEZ-GUERRERO A M， POZO-GUISADO E， et al. Calcium signalling in mouse oocyte maturation： the roles of STIM1， ORAI1 and SOCE[J]. Mol Hum Reprod，2012，18（4）：194-203.

[9] GOMEZ-FERNANDEZ C， POZO-GUISADO E， GANAN-PARRA M， et al. Relocalization of STIM1 in mouse oocytes at fertilization： early involvement of store-operated calcium entry[J]. Reproduction， 2009， 138（2）： 211-221.

[10] YAN X， XING J， LORIN-NEBEL C， et al. Function of a STIM1 homologue in C. elegans： evidence that storeoperated Ca2+ entry is not essential for oscillatory Ca2+ Signaling and ER Ca2+ homeostasis[J].J Gen Physiol，2006，128（4）：443-459.

[11] LORIN-NEBEL C， XING J， YAN X， et al. CRAC channel activity in C. elegans is mediated by Orai1 and STIM1 homologues and is essential for ovulation and fertility[J]. J Physiol， 2007， 580 （Pt1）：67-85.

[12] CHEN Y F， CHIU W T， CHEN Y T， et al. Calcium store sensor stromal-interaction molecule 1-dependent signaling plays an important role in cervical cancer growth， migration， and angiogenesis[J]. Proc Natl Acad Sci USA，2011，108 （37）： 15225-15230.

[13] MCANDREW D， GRICE D M， PETERS A A， et al. ORAI1-mediated calcium influx in lactation and in breast cancer[J]. Mol Cancer Ther， 2011， 10（3）： 448-460.

[14] RITCHIE M F， ZHOU Y， SOBOLOFF J. WT1/EGR1-mediated control of STIM1 expression and function in cancer cells[J]. Front Biosci， 2011， 16： 2402-2415.

[15] LEE K， WANG C， MACTHATY Z. STIM1 is required for Ca2+ signaling during mammalian fertilization[J]. Developmental Biology， 2012， 367（2）： 154-162.