稻瘟病菌孢子的分离和保存方法

赵沙沙　田永宏　余华强　孙永建　曹国长　陈波　房振兵　范兵

摘要：介绍了稻瘟病菌[Magnaporthe grisea（Hebert）Barr]孢子的分离和保存方法，并加以比较和分析。结果表明，将发病组织进行保湿培养，产孢后用洗耳球将孢子吹到培养基上挑取单一菌落，采用滤纸片法保存，可以很好地分离和保存稻瘟病菌单孢。

关键词：稻瘟病菌[Magnaporthe grisea（Hebert）Barr]； 单孢； 分离； 保存

中图分类号：S432.4+4 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）24-6252-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.24.040

Abstract： The methods of isolation and preservation of single spore of rice blast fungus were introduced， which were taken into comparison and analysis. The results showed that the diseased tissues were cultured by moisture-retaining， then the spores produced were blown into the plate culture medium to pick a single colony with ear washing bulb and preservated by filter paper method， which could isolate and preservate the single spore of rice blast fungus commendably.

Key words： rice blast fungus[Magnaporthe grisea（Hebert）Barr]； single spore； isolation； preservation

由稻瘟病菌[Magnaporthe grisea（Hebert）Barr]引起的稻瘟病是世界上水稻三大病害之一，给水稻的产量和质量造成了严重的影响。长期的生产实践证明，选育和种植抗稻瘟病品种是防治稻瘟病最经济、有效和安全的措施，符合人类对绿色食物的要求[1]。选育抗稻瘟病品种需要在田间对待选材料苗期、分蘖盛期和孕穗初期进行人工接种鉴定，选择出抗病且大田表现较好的水稻材料，其中关键的一个环节就是获取足够量的接种体——稻瘟病菌分生孢子。这就需要从发病的水稻标样上分离得到不同稻瘟病菌株的单孢并加以保存。本研究介绍了稻瘟病菌孢子的一些分离和保存方法，并加以比较和分析，为育种工作者分离和保存稻瘟病菌孢子并进行接种鉴定提供参考。

1 稻瘟病菌孢子的分离方法

1.1 手工直接挑取孢子的单孢分离法

张君成[2]的单孢分离法是用手工直接挑取孢子，所需材料设备比较简单，但操作难度大，技巧性强。首先在酒精灯上将接种针针尖烧红，然后用镊子将针尖弯曲1 cm左右，制成所需要的接种针。用无菌刀片将清水琼脂（WA）平板切成2 cm×1 cm的琼脂块，挑取一块置于无菌的载玻片上，制成挑孢琼脂块。

在超净工作台上，取出穗颈瘟标样，用接种针的弯曲部分轻轻触碰标样黏附孢子，然后沿挑孢琼脂块的对角线轻轻划一下，将孢子转移到挑孢琼脂块表面。将含有孢子的琼脂块放到载物台上，寻找分散的单个孢子，并将其移至视野中央。用接种针轻轻靠碰视野中央的单个孢子，使孢子黏附到针尖上，然后轻轻抬起针头，移离显微镜。

左手取准备好的试管斜面培养基，右手将黏有孢子的接种针小心移入试管内，在培养基斜面上将针尖快速滑动1～4次，即可将孢子释放到培养基上，适温培养后长成单孢菌落。

手工直接挑取单孢的方法所需材料设备简单易得，试验过程在一般的场地即可进行，并且适用性好，可以分离不同大小和种类的孢子，但是这种方法操作难度比较大，技巧性强，对操作人员的要求很高，初学者一般很难掌握。

1.2 连续变倍体视显微镜单孢分离法

张书建等[3]在平板稀释法和震落法的基础上进行改良，总结出了一种较为简单、准确、快速的单孢分离法。首先对发病的组织进行保湿培养。取新采集的穗颈瘟标样，浸泡在体积分数75%乙醇中消毒30 s，然后用无菌水冲洗3次。在一次性培养皿中放入2层吸水纸或1张滤纸，加入少量无菌水，浸湿吸水纸或滤纸即可。然后把消过毒的穗颈瘟标样放在培养皿内，盖好后室温保湿2～3 d，直至标样表面出现深灰色的霉层。

用无菌的镊子夹起已长出霉层的发病组织，在清水琼脂（WA）平板的上方用力持续捏洗耳球，产生的气流就会带动孢子落在培养基上。此时，应注意标样上不要有水珠，否则容易造成污染。然后适温培养8～12 h，直至大多数孢子已萌发但尚未进行分枝。

将连续变倍体视显微镜放在超净工作台上，把带有孢子的WA平板放在载物台上，在视野中寻找刚萌发尚未进行分支的分散的单个孢子，然后用接种针轻轻挑取一小块孢子所在位置的培养基，转入试管斜面培养基中，且带有孢子的一面紧贴培养基表面，适温培养后得到单孢菌株。

稻瘟病菌的产孢过程属于营养贫瘠型，连续变倍体视显微镜单孢分离法就利用了稻瘟病菌产孢的这一特点。对发病的组织先进行保湿培养，使其在贫瘠的营养条件下产孢，再尽可能地将单个孢子分离出来，可以显著提高稻瘟病菌分离孢子的成功率。这种方法用洗耳球直接将孢子从发病标样吹到平板培养基上，这样可以方便地进行镜检分离单孢，并且连续变倍体视显微镜分离孢子时优于普通生物学显微镜，便于操作。该方法的不足之处是发病标样上可能有其他杂菌，连同孢子一起吹到培养基上，造成污染，并且标样上可能有多个稻瘟病生理小种，最后获得的不一定是单孢菌株。

1.3 毛细管打孔单孢分离法

董娟华等[4]用毛细管打孔法进行单孢分离。将2 g琼脂粉加入到100 mL无菌水中，灭菌后制成2%水琼脂。在超净工作台上，用无菌移液枪吸取水琼脂涂布在无菌载玻片上，制成厚度均匀的水琼脂片。用无菌接种针黏取发病标样上的孢子，并将其黏附到水琼脂片上，然后用灭菌玻璃棒沾取无菌水，稀释涂布孢子。在显微镜下观察涂有孢子的水琼脂片，找到分散的单个孢子后，将其移入视野中央，然后下移载物台。取内径为1 mm弯成直角的毛细管灭菌后，短臂端部对准物镜镜头下的光斑中央，在水琼脂上打取直径为1 mm的琼脂饼。然后观察琼脂饼上是否有目标孢子，如果没有，则重新选取孢子，直至琼脂饼上有单个孢子。

用无菌接种针挑取带有目标孢子的琼脂饼，转入试管斜面培养基中，并使带有孢子的一面紧贴培养基表面，适温培养后得到纯化的单个菌株。

毛细管打孔单孢分离法可操作性强，污染少，单孢分离成功率比较高，特别适合强寄生真菌的分离培养。但是操作过程有些复杂，分离速度较慢，并且所需工具制作繁琐。

1.4 挑针转移法

邱小燕等[5]通过组织分离、孢子悬浮液涂布和挑针转移等步骤，研究出一种可靠并且适应性广泛的单孢分离技术。将采集回的穗颈瘟标样，浸泡在体积分数75%乙醇中消毒30 s，然后用无菌水冲洗3次。用灭菌的镊子夹起标样，放在灭菌后的滤纸上吸收多余水分，然后置于燕麦片培养基平板上，27 ℃黑暗培养。

培养5～10 d后，取出已经充分产孢的稻瘟病菌，在超净工作台上用接种针挑取一小块布满菌丝的培养基，放在无菌空试管中，加入4～5 mL无菌水，力度适中地振荡数次后制成孢子悬浮液。用玻璃棒蘸取一滴孢子悬浮液涂布在载玻片上，并在显微镜下镜检计数，将孢子悬浮液的浓度调节为40倍视野下一个孢子。将制备好的孢子悬浮液静置2～3 min后，直接将试管上半部分的孢子悬浮液倒入WA平板中，然后用灭菌涂布器涂布均匀，并用无菌风吹干。封口膜密封后28 ℃培养10 h左右，用于后续的单孢分离。

用解剖刀将制备好的涂布有孢子悬浮液的WA平板切成1.5 cm×5.0 cm左右的小块，然后把琼脂块放到载玻片上，40倍显微镜下调节视野，使视野中央只有分散的单个孢子。然后用解剖刀小心切下视野中央的琼脂块，并通过显微镜观察琼脂块中只有一个孢子。最后用接种针挑取带有单个孢子的琼脂块，转移至试管斜面培养基中，且带有孢子的一面紧贴培养基表面，适温培养后得到纯化的单个菌株。

挑针转移法所需材料设备简单，可以保证所挑单孢的可靠性，并且成功率高，适用性广，但操作过程相对而言仍有些繁琐。

通过对稻瘟病菌几种分离单孢方法的优缺点进行分析，认为将发病组织进行保湿培养，产孢后用洗耳球将孢子吹到平板培养基上进行培养可以很好地分离稻瘟病菌单孢。该方法的不足之处是发病标样上可能有其他杂菌或者多个稻瘟病菌生理小种，最后获得的不一定是单孢菌株。但可以挑取平板培养基上的单一菌落，并分别保存以获得单一的、纯化的稻瘟病菌菌株。

2 稻瘟病菌孢子的保存方法

2.1 干燥低温保存法

孔秀英[6]用干燥低温的方法可以短期保存稻瘟病菌的分生孢子。首先将平板培养基上的孢子洗下制成孢子悬浮液，然后用真空泵将孢子收集在滤纸上进行干燥，干燥后的带有孢子的滤纸放入干燥器内，-20 ℃冷冻保存。几个月后稻瘟病菌的致病性基本没有变化，可以在平板培养基上活化后使用。干燥低温保存法可以短期保存稻瘟病菌株，但需要抽真空，略显复杂。

2.2 高粱粒保存法

将高粱粒煮至八分熟，用清水冲洗几遍直至水澄清后，沥干水装入锥形瓶中，塞上棉塞，牛皮纸封口，灭菌（至少40 min）后使用。在超净工作台，在试管斜面培养基中挑取一块长满菌丝的培养基放入装有高粱粒的锥形瓶中，密封后室温保存。7 d后，部分高粱粒长有菌丝，将其摇散扩大培养。两周后，所有的高粱粒上即可长满菌丝。取一些长满菌丝的高粱粒放入小试管中，试管塞封口。大约15 d等高粱粒完全干燥后，-20 ℃冷冻保存。使用时在培养基上活化即可。高粱粒保存法可以大量地保存稻瘟病菌株，但保存过程复杂，容易发生霉变污染，并且保存时所占体积较大。

2.3 滤纸片保存法

金晓春等[7]用一种简单可靠的滤纸片法保存稻瘟病菌分生孢子。将分离得到的稻瘟病菌单孢在试管斜面培养基上培养10 d左右，等培养基上长满菌丝后，将滤纸片剪成若干小纸片灭菌后放入斜面中，使滤纸片紧贴斜面，2～3 d后滤纸片即可长满孢子。取出滤纸片，在超净工作台中用无菌风吹干，装入灭菌的硫酸纸袋中-20 ℃冷冻保存。使用时在平板培养基上活化即可。

滤纸片保存法所需工具简单，操作简便，污染较少，所占空间也小，并且经过很长一段时间后，稻瘟病菌的致病性基本没有变化，可以很好地用来保存稻瘟病菌的孢子。

干燥和低温是延长孢子存活期，稳定稻瘟病菌致病性的两个主要因素，其中干燥尤为重要，而低温只有在干燥的前提下才能发挥作用。分离的稻瘟病菌株用滤纸片法保存，平板培养基活化后仍能保持很强的活性和致病性。

通过比较和分析稻瘟病菌几种分离和保存孢子的方法，认为用病组织保湿法分离单孢和滤纸片法保存菌种，提高了分离的效率，降低了保存的难度，为今后培养大量的稻瘟病菌并进行接种鉴定奠定了很好的基础。

参考文献：

[1] 刘占领，雷财林，程治军，等.水稻稻瘟病抗性基因定位与克隆研究进展[J].作物杂志，2007（3）：16-19.

[2] 张君成.手工挑取真菌单孢子显微操作技巧[J].植物保护，2008，34（2）：98-100.

[3] 张书建，何月秋.介绍一种简单的真菌单孢子分离法[J].云南农业大学学报，2003，18（3）：315-316.

[4] 董娟华，罗 丽，王彩霞，等.一种强寄生病原真菌的分离方法——毛细管打孔单孢分离法[J].中国农学通报，2009，25（3）：210-212.

[5] 邱小燕，汤智鹏，张 敏，等.一种适用于多数植物病原真菌的单孢分离方法[J].安徽农业科学，2011，39（9）：5263-5264.

[6] 孔秀英.稻瘟病菌分生孢子的诱发及保存方法[J].微生物学通报，1995，22（5）：308-310.

[7] 金晓春，李志新，张海生，等.稻瘟病菌分离及保存方法研究[J].安徽农业科学，2008，36（17）：7308，7390.