七氟醚预处理对大鼠肝缺血再灌注致肺损伤的干预作用及机制探讨

七氟醚预处理对大鼠肝缺血再灌注致肺损伤的干预作用及机制探讨

王晓丽1，徐桂萍2，管小萌1

(1新疆医科大学，乌鲁木齐830000；2新疆维吾尔自治区人民医院)

摘要：目的观察七氟醚预处理对肝缺血再灌注致肺损伤的干预作用，并探讨其机制。方法健康Wistar大鼠30只，随机分为假手术组、模型组、七氟醚组，每组10只。模型组与七氟醚组制作部分肝缺血再灌注模型，其中七氟醚造模前给予七氟醚吸入30 min；假手术组仅游离肝门，但不阻断血供。于再灌注60 min时处死大鼠，测血清ALT、AST、TNF-α；取部分右肺上叶组织用于测算湿重与干重比值(W/D)，部分制作石蜡切片用于病理观察；取左肺组织，测定丙二醛(MDA)及MMP-9 mRNA。结果光镜下假手术组肺组织结构未见异常；七氟醚组肺组织损伤程度较模型组减轻。模型组、七氟醚组血清ALT、AST、TNF-α水平升高，与假手术组相比，P均<0.05；七氟醚组血清ALT、AST、TNF-α水平低于模型组(P均<0.05)。模型组、七氟醚组肺组织W/D、MDA含量及MMP-9 mRNA相对表达量均升高，与假手术组相比，P均<0.05；七氟醚组肺组织W/D、MDA含量及MMP-9 mRNA相对表达量低于模型组(P均<0.05)。结论 七氟醚可减轻肝缺血再灌注导致的肺损伤，机制可能与降低TNF-α水平、抑制MMP-9 mRNA表达等有关。

关键词：七氟醚；肝缺血再灌注；肺损伤；动物实验模型

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.39.006

中图分类号：R971+.2 文献标志码：A

基金项目：国家自然科学基金资助项目(81160016)。

作者简介：第一王晓丽(1989-)，女，在读研究生，研究方向为七氟醚的器官保护作用。E-mail： 290818040@qq.com

作者简介：通信徐桂萍(1967-)，女，主任医师，教授，硕士生导师，研究方向为七氟醚的器官保护作用。E-mail: XGPSYL@126.com

收稿日期：(2015-07-02)

Intervention of sevoflurane pretreatment on rat pulmonary injury caused

by liver ischemia reperfusion and its mechanism

WANGXiao-li1,XUGui-ping,GUANXiao-meng

(1XinjiangMedicalUniversity,Urumqi830000,China)

Abstract:ObjectiveTo observe the intervention of sevoflurane pretreatment on rat pulmonary injury caused by liver ischemia reperfusion and to explore its mechanism. MethodsA total of 30 healthy Wistar rats were randomly divided into sham-operation group, the model group and the sevoflurane group, with 10 rats in each group. Models of liver ischemia reperfusion were established in the model group and sevoflurane group, and rats of the sevoflurane group were given inhalation of sevoflurane for 30 min before modeling; while in the sham-operation group, only porta hepatis was separated but blood supply was not blocked. Rats were scarified at 60 min after reperfusion, and the serum alanine aminotransferase (ALT), aspertate aminotransferase (AST) and tumor necrosis factor-α (TNF-α) were detected; part of right upper lobe was used to measure the wet/dry weight ratio (W/D ratio) and part was used to make paraffin section for pathological observation; and left lung tissue was taken to determine malondialdehyde (MDA) and MMP-9 mRNA. ResultsLung tissue of the sham-operation group was normal in structure under microscopy, while damage degree of lung tissue in the sevoflurane group was reduced as compared with that of the model group. Serum ALT, AST and TNF-α of the model group and sevoflurane group were increased as compared with those of the shan-operation group (all P<0.05); while serum ALT, AST and TNF-α of the sevoflurane group was lower than that of the model group (all P<0.05). W/D ratio, MDA content and relative expression of MMP-9 mRNA in the lung tissues of the model group and sevoflurane group were increased as compared with those of the sham-operation group (all P<0.05); W/D ratio, MDA content and relative expression of MMP-9 mRNA in the lung tissues of the sevoflurane group were lower than those of the model group (all P<0.05). ConclusionSevoflurane can alleviate the pulmonary injury caused by liver ischemia reperfusion, whose mechanism may be related to the lower levels of TNF-α and inhibition of MMP-9 mRNA expression, etc.

Key words: sevoflurane; liver ischemia reperfusion; lung injury; animal experiment model

肝缺血再灌注引起的肺损伤是全身炎症反应失衡的结果[1，2]。已有研究证实缺血再灌注的器官因组织受损可向循环中释放细胞因子及其他促炎介质，造成多脏器功能障碍[3]。最近研究[4,5]报道，肝组织MMP-9表达与缺血再灌注损伤有关。基质金属蛋白酶已成为多器官功能障碍的治疗靶点之一[6]。七氟醚被证实能减轻脏器的缺血再灌注损伤[7~9]。2014年3~9月，本研究建立了大鼠部分肝缺血再灌注模型，并观察了七氟醚预处理对肝缺血再灌注引起的肺损伤的干预作用。

1材料与方法

1.1实验动物与分组健康成年雄性Wistar大鼠30只，体质量270~330 g，由新疆医科大学实验动物中心提供。实验前大鼠禁食12 h，自由饮水，采用随机数字表法分为假手术组、模型组和七氟醚组。

1.2模型制作及七氟醚用法模型组与七氟醚组参照文献[10]方法制备70%部分肝缺血再灌注模型：以2%戊巴比妥钠(80 mg/kg)腹腔注射麻醉，气管切开插管，接小动物呼吸机行机械通气；机械通气30 min后，取上腹正中切口逐层剪开腹壁各层，游离肝脏，剪除韧带及系膜，在肝蒂中分离出进入肝左叶及中叶的血管；经颈内静脉注入50 U肝素5 min后，用血管夹钳夹肝左、中叶血供造成70%肝脏缺血；阻断30 min后松开血管夹恢复血液循环。七氟醚组造模前将呼吸机的进气口与装有七氟醚挥发罐的麻醉机呼吸回路末端相连，于肝门阻断前吸入2.0%七氟醚[11]30 min，停止吸入后制备模型。假手术组仅游离肝脏但不阻断血供。

1.3观察方法于再灌注60 min时处死大鼠，经腹主动脉采血2 mL，测血清ALT、AST、TNF-α；取右肺上叶组织用于测算湿重与干重比值(W/D)；取右肺组织，用4%甲醛固定，制作石蜡切片用于肺组织病理观察；取左肺组织速置于-80 ℃冰箱中保存，用于测定丙二醛(MDA)及MMP-9 mRNA。

1.3.1肺组织病理观察取部分左肺上叶组织，4%中性甲醛固定，常规石蜡包埋，5 μm切片，HE染色，光镜下观察肺组织病理变化。

1.3.2血清AST、ALT、TNF-α检测采用Olympus2700型全自动生化分析仪测定血清ALT、AST。采用双抗体夹心ELISA法测定血清TNF-α。

1.3.3W/D测算取右肺上叶组织用生理盐水冲洗表面血迹，用滤纸吸干表面水分称湿重，将组织放在70 ℃电热恒温鼓风干燥箱中24 h后称干重，两者比值为W/D。

1.3.4MDA检测取部分-80 ℃冰箱保存的左肺组织，制成10%组织匀浆，采用比色法测定MDA。

1.3.5MMP-9 mRNA检测采用RT-PCR法。取部分-80 ℃冰箱保存的左肺组织，提取总RNA，反转录成cDNA，然后进行RT-PCR反应。MMP-9上游引物序列为5′-CCCTGCGTATTTCCATTCATC-3′，下游引物序列为5′-AACCATCCGAGCGACCTTT-3′，产物长度73 bp；内参β-actin上游引物序列为5′-CGTAAAGACCTCTATGCCAACA-3′，下游引物序列为5′-AGCCACCAATCCACACAGAG-3′，产物长度163 bp。取PCR产物5 μL于2%琼脂糖凝胶进行电泳，用凝胶图像分析系统扫描测定PCR扩增条带的吸光度值，以MMP-9条带吸光度值与β-actin条带吸光度值之比表示MMP-9 mRNA相对表达量。

1.4统计学方法采用SPSS17.0统计软件。计量资料以±s表示，组间、组内比较采用单因素方差分析。P<0．05为差异有统计学意义。

2结果

2.1三组肺组织病理变化光镜下假手术组肺组织结构未见异常；模型组肺间质增生，肺泡壁增厚，肺泡上皮细胞增多，肺泡壁毛细血管明显扩张充血，肺泡壁及肺泡间质中可见大量中性粒细胞；七氟醚组肺损伤较模型组减轻，但仍可见肺间质不同程度增生，肺泡壁毛细血管充血，肺间质炎症细胞浸润，肺泡结构仍受到损伤。模型组及七氟醚组随灌注时间延长，肺组织损伤程度逐渐加重。

2.2三组血清AST、ALT、TNF-α水平比较模型组、七氟醚组血清ALT、AST、TNF-α水平升高，与假手术组相比，P均<0.05；七氟醚组血清ALT、AST、TNF-α水平低于模型组(P均<0.05)。见表1。

表1　三组血清AST、ALT、TNF-α水平比较( ± s)

表1　三组血清AST、ALT、TNF-α水平比较( ± s)

组别ALT(U/L)AST(U/L)TNF-α(ng/mL)假手术组29±9.3037±6.714.07±0.13模型组655±52.06*693±75.56*5.36±0.28*七氟醚组464±47.71*#516±78.84*#4.45±0.25*#

注：与假手术组相比，*P<0.05 ；与模型组相比，#P<0.05。

2.3三组肺组织W/D、MDA含量及MMP-9 mRNA相对表达量比较模型组、七氟醚组肺组织W/D、MDA含量及MMP-9 mRNA相对表达量均升高，与假手术组相比，P均<0.05；七氟醚组肺组织W/D、MDA含量及MMP-9 mRNA相对表达量低于模型组(P均<0.05)。见表2。

表2　 三组肺组织W/D、MDA含量及MMP-9 mRNA

相对表达量比较( ± s)

表2　 三组肺组织W/D、MDA含量及MMP-9 mRNA

组别W/D(%)MDA(nmol/mg)MMP-9mRNA假手术组3.51±0.320.53±0.100.84±0.66模型组4.70±0.43*0.88±0.18*3.95±0.13*七氟醚组4.43±0.24*#0.74±0.12*#3.46±0.15*#

注：与假手术组相比，*P<0.05；与模型组相比，#P<0.05。

3讨论

目前，单器官缺血再灌注引起多器官功能障碍的机制尚未明确，现已知氧毒性及自由基产物等在其进展过程中发挥重要作用[12]。研究[13]表明，损伤的肝组织向循环内释放促炎细胞因子和氧自由基是引起远隔脏器损伤的原因，其中以肺功能障碍多见。七氟醚麻醉诱导迅速，维持平稳，苏醒快速、完全，目前证实其可减轻缺血再灌注肝损伤，作用可能是减少自由基生成、减轻膜脂质过氧化反应等。ALT、AST为肝功能指标，本研究发现，七氟醚组血清ALT、AST水平高于假手术组，但低于模型组，表明七氟醚预处理可减轻缺血再灌注引起的肝细胞损伤，与相关研究结果一致。

MDA是氧自由基与生物膜中不饱和脂肪酸作用的产物，MDA可反映氧自由基水平及脂质过氧化反应程度。相关研究[6]表明，TNF-α作为炎症因子，可协同IL-1β、IL-8等激活MMPs降解细胞外基质，参与肝损伤及肺损伤中细胞外基质的退化过程[14]。MMP-9是MMPs家族中的一员，在肝缺血再灌注所致肺损伤组织中，MMP-9活性增加[5，15]，故检测TNF-α及MMP-9可反映缺血再灌注肝损伤及肺损伤的情况。本研究结果显示，模型组及七氟醚组大鼠肺组织有病理改变，其中七氟醚组程度较轻；七氟醚组肺组织W/D高于模型组，表明七氟醚处理后大鼠毛细血管通透性得到改善。模型组、七氟醚组MDA含量及MMP-9 mRNA相对表达量均较假手术组升高，其中七氟醚组肺组织W/D、MDA含量及MMP-9 mRNA相对表达量低于模型组，提示七氟醚对肺损伤的干预作用机制可能与降低TNF-α水平、下调MMP-9 mRNA表达等有关，具体机制仍有待于深入研究。

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