COX-2mRNA在骨关节炎性病变过程中的作用研究

论著

COX-2mRNA在骨关节炎性病变过程中的作用研究

李冠甘丽娇钟妙容

作者单位： 516002广东省惠州市第三人民医院风湿免疫科

【摘要】目的探讨环氧化酶-2基因(COX-2 mRNA)在骨关节炎性病变中的变化及其作用。方法以风湿免疫科2010至2014年收治的51例膝骨性关节炎患者(病例组)及20例非膝骨性关节炎患者(对照组)为研究对象，根据膝骨性关节炎的病变进程分为早期组(17例)、中期组(19例)和晚期组(15例)，分别采用实时荧光定量法(RT-PCR)检测各组患者的成纤维样滑膜细胞中COX-2mRNA表达水平、采用Western-blot法检测各组COX蛋白表达水平。结果病例组患者成纤维细滑膜样细胞中COX-2mRNA及蛋白表达灰度值分别为0.76±0.11、0.85±0.09均显著高于对照组(P<0.05)。早期组、中期组、晚期组患者和对照组成纤维细滑膜样细胞中COX-2mRNA及蛋白表达灰度值差异有统计学意义(P<0.05)；早期组COX-2mRNA及蛋白表达灰度值分别为0.92±0.09、0.98±0.09，均显著高于中期组、晚期组患者和对照组(P<0.05)；中期组、晚期组患者COX-2mRNA及蛋白表达灰度值差异无统计学意义(P>0.05)；中期组、晚期组患者COX-2mRNA及蛋白表达灰度值显著高于对照组(P<0.05)。结论膝骨性关节炎患者成纤维细滑膜样细胞中COX-2mRNA及蛋白表达水平显著高于非股性关节炎患者，同时表达水平早期最高，说明环氧化酶-2基因可能主要作用于膝骨性关节炎患者炎症病变的早期。

【关键词】环氧化酶-2基因；骨关节炎；病变；作用

doi:10.3969/j.issn.1002-7386.2015.20.007

【中图分类号】R 684

收稿日期：(2015-02-02)

Study on the role of COX-2mRNA in the process of inflammatory lesion of bone and jointLIGuan,GANLijiao,ZHONGMiaorong.DepartmentofRheumatology,TheThirdPeople’sHospitalofHuizhouCity,Guangdong,Huizhou516002,China

Abstract【】ObjectiveTo observe the changes of cyclooxygenase-2 gene (COX-2 mRNA) in the process of inflammatory lesion of bone and joint,and to explore its effects on the lesions.MethodsFifty-one patients with knee osteoarthritis (case group) and 20 patients with non knee osteoarthritis (control group) who were admitted into Department of Rheumatism Immunization Diseases of our hospital from 2010 to 2014 were enrolled in the study. According to the process of inflammatory lesion of bone and joint,these patients were redivided into early period group (n=17),middle period group (n=19) and late period group (n=15).The expression levels of COX-2mRNA in fibroblast like synovial cells were detected by Real-time fluorescence quantitative PCR (RT-PCR),and the expression levels of COX protein were detected by Western Blot.ResultsThe expression gray values of COX-2mRNA and protein in fibroblast like synovial cells in case group were 0.76±0.11,0.85±0.09,respectively, both of them were significantly higher than those in control group (P<0.05). There were significant differences in the expression gray values of COX-2mRNA and protein among early period group,middle period group,late period group (P<0.05). The expression gray values of COX-2mRNA and protein in early period group were 0.92±0.09,0.98±0.09,respectively, both of them were significantly higher than those in middle period group,late period group and control group (P<0.05),however, there were no significant differences in the expression gray values of COX-2mRNA and protein between middle period group and late period group (P>0.05). The expression gray values of COX-2mRNA and protein in middle period group and late period group were significantly higher than those of control group(P<0.05).ConclusionThe expression gray values of COX-2mRNA and protein in fibroblast like synovial cells in patients with knee osteoarthritis are significantly higher than those of patients with non knee osteoarthritis,moreover, the expression levels are the highest at early period,which suggests that cyclooxygenase-2 gene may play an important role in early period of inflammatory lesions of bone and joint in patients with knee osteoarthritis.

【Key words】cyclooxygenase-2 gene; osteoarthritis; lesions; role

骨关节炎(osteoarthritis，OA)是一种以关节软骨进行性损害的慢性退行性病变[1]，可由高龄、肥胖、关节长时间过度劳损、创伤等因素引起关节软骨发生破损，而关节周边和软骨下骨代偿性增生。金属基质蛋白酶(MMPs)和多种炎性因子在OA病变过程中起到重要作用，前者在OA的慢性降解中发挥重要作用，后者对关节炎性病变的发展具有重要影响。环氧合酶-2(COX-2)在前列腺素合成过程中发挥重要作用，其控制着合成反应的速度及产物的合成量，间接调控者前列腺素的生物学效应，调节血管的生成和炎性因子的释放，促进OA的进展[2]。本文通过分析COX-2在不同分期骨关节炎患者中的含量，以探讨其在OA中的作用。

1资料与方法

1.1一般资料以本院风湿免疫科2010至2014年收治的51例膝骨性关节炎患者(病例组)及20例非膝骨性关节炎患者(对照组)为研究对象。病例组51例，男14例，女37例；年龄37～76岁，平均年龄(58.1±11.2)岁；对照组20例，男5例，女15例；年龄35～70岁，平均年龄(54.3±12.8)岁。

1.2纳入标准所有患者的诊断均符合2007年中华医学会骨关节分会制定的膝骨性关节炎的诊断标准[4]；X线Kellgren-Lawrence分级为Ⅰ～Ⅳ级；均在本院接受相关检查及治疗；对照组患者来自于单纯半月板损伤、前交叉韧带损伤及单纯外伤患者。

1.3排除标准合并严重的心、肺、肾、脑等部位的严重疾病或精神性疾病的患者；合并其他类型的风湿性疾病患者；近2个月采用激素治疗的患者；孕期或哺乳期女性。

1.4分组方法比较病例组和对照组的成纤维样滑膜细胞中COX-2mRNA、蛋白表达水平。并根据X线Kellgren-Lawrence分级标准将病例组患者分为早期组(17例，Ⅰ～Ⅱ级)、中期组(19例，Ⅲ级)和晚期组(15例，Ⅳ级)与对照组进行比较。

1.5RT-PCR方法关节镜手术取出的滑膜组织，无菌条件下剪碎、碾磨，用Trazol溶液提取对照组和病例组滑膜组织中的总RNA，按照反转录试剂盒说明书合成cDNA。设计COX-2mRNA引物，上游序列为：5’-GGTCTGGTGCCTGGTCTGATGATG-3’；下游序列为：5’-GTCCTTTCAAGGAGAATGGTGC-3’。内参基因序列为β-actin：上游序列为：5’-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3’，下游序列为：5’-CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3’。取对照组和病例组各1.5 μl的cDNA作为模版，分别加入1 μl dNTP，2.5 μl 10×buffer，经过高温变性、退火后进行PCR仪检测。

1.6Western-blot法取对照组和病例组的软骨组织，经过细胞裂解液、超声破碎仪处理后，离心，收集上清，然后进行SDS-PAGE凝胶电泳。获得蛋白质转移至硝酸纤维素膜(NC)上，25℃封闭60 min，然后加入COX-2蛋白抗体，37℃孵育2 h，多次漂洗后加入二抗，25℃孵育2 h，多次漂洗后，数码摄像。

2结果

2.1病例组和对照组的成纤维细滑膜样细胞中COX-2mRNA及蛋白表达情况病例组患者成纤维细滑膜样细胞中COX-2mRNA及蛋白表达灰度值分别为0.76±0.11、0.85±0.09，均显著高于对照组(P<0.05)。见表1，图1。

表1　2组患者成纤维细滑膜样细胞中COX-2mRNA及

图1病例组和对照组成纤维细滑膜样细胞中COX-2mRNA及

蛋白表达情况

2.2不同膝骨性关节炎病变程度患者成纤维细滑膜样细胞中COX-2mRNA及蛋白表达情况早期组、中期组、晚期组患者和对照组成纤维细滑膜样细胞中COX-2mRNA及蛋白表达灰度值差异有统计学意义(P<0.05)；早期组COX-2mRNA及蛋白表达灰度值分别为0.92±0.09、0.98±0.09，均显著高于中期组、晚期组和对照组(P<0.05)；中期组、晚期组COX-2mRNA及蛋白表达灰度值差异无统计学意义(P>0.05)；中期组、晚期组患者COX-2mRNA及蛋白表达灰度值显著高于对照组(P<0.05)。见表2，图2。

表2　不同膝骨性关节炎病变程度患者COX-2mRNA及蛋白表灰度值　 ±s

注：与对照组比较,*P<0.05;与早期组比较,#P<0.05

3讨论

骨关节炎根据有无局部和全身致病因素可分为原发性骨关节炎和继发性骨关节炎[3]，到目前为止前者的致病因素仍不确切，可能与老龄、女性、肥胖及关节长时间过度劳累有关；后者可因关节炎症、代谢和内分泌异常导致[4]。骨关节炎患者主要表现为关节疼痛，尤其是清晨起床后关节疼痛明显，适度活动后疼痛减轻，但若过度活动会使疼痛加重。病变关节主要的症状为肿胀、压痛、关节活动时有响声，严重者可有关节畸形。临床上常进行血沉、血常规、X线、CT及MRI等检查。结合患者病史和X线表现诊断该病并不困难，必要时可进行关节液检查。目前，骨关节炎尚无特效药，临床治疗的主要目的是减轻关节的负重，延缓病情进展，缓解患者症状。非甾体消炎药和镇痛药常用于急性期患者缓解症状，关节置换术是晚期患者主要的治疗措施，是矫正畸形、消除症状的最佳方法[5]，可明显提高患者的生活质量。

图2　不同膝骨性关节炎病变程度患者COX-2mRNA及蛋白表灰度值

OA主要的病理改变是软骨组织的进行性退变，实质上是软骨细胞的合成和凋亡平衡紊乱，软骨细胞分泌的一些细胞因子增多，造成细胞外基质成分的不断流失和软骨细胞结构和功能的改变[6]。

COX是前列腺素合成的必要蛋白酶，而前列腺素在机体的多种机能活动中发挥重要作用。人体内的COX主要有两种同工酶，COX-1和COX-2[7]。COX-1参与机体的生理活动，如胃黏膜的保护和调节血小板聚集等，后者则在炎症和肿瘤的发病过程中发挥作用。正常情况下，人体内不含有COX-2，只有在炎症或肿瘤等病理刺激下体内才可检测到COX-2。骨关节炎病理表现为滑膜炎，软骨细胞分泌的IL-1和肿瘤坏死因子(TNF-α)可促进滑膜炎症的进展和软骨结构的损害。IL-1作用于软骨细胞和滑膜细胞，激活G蛋白偶联系统和络氨酸酶激酶系统[8]，使转录调节因子的活性增加，促进COX-2mRNA的合成和转录。COX-2可使关节中PGF2含量明显增加，使软骨基质中的蛋白多糖和Ⅱ型胶原发生分解代谢[9]，并抑制它们的合成代谢，使软骨破坏与合成平衡失调，破坏大于合成。关节液中TNF-α浓度的增加，可促使COX-2浓度增加，进而促使COX-2发挥其生物学效应。TNF-α还可直接抑制Ⅱ型胶原和连接蛋白的基因表达过程[10]，使软骨基质无法合成。

据报道，采用COX-2选择抑制剂治疗OA患者，可明显减轻患者关节软骨的损害[11]。本文病例组患者成纤维细滑膜样细胞中COX-2mRNA及蛋白表达明显高于对照组，说明OA患者受累关节内COX-2基因处于高表达，为临床选择COX-2选择性抑制剂药物治疗提供理论依据。本文还发现早期组COX-2mRNA及蛋白表达高于中期组、晚期组患者，都高于对照组患者，但中期组、晚期组患者COX-2mRNA及蛋白表达相当，说明COX-2基因在疾病早期表达最高，该时期选择COX-2选择性抑制剂治疗，其疗效可能更佳，但本文样本量较小，且目前尚无相关文献证实[12]，故其说服力稍显不足。因此，后续研究针对不同分期OA患者受累关节内的COX-2基因的表达及作用机制的研究十分必要。

综上所述，膝骨性关节炎患者的成纤维细滑膜样细胞中COX-2mRNA及蛋白表达水平显著高于非骨性关节炎患者，且在病变早期表达量最高，说明COX-2在OA病变软骨组织的损害过程中占据重要地位，抑制COX-2基因的表达可有效缓解关节软骨的破坏。

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