miR129在胃腺癌中的表达及意义

论著

miR129在胃腺癌中的表达及意义

牟时斌牟云高峰

作者单位： 054900河北省临西县人民医院(牟时斌);河北省民政总医院(牟云);河北医科大学第三医院(高峰)

【摘要】目的探讨microRNA129(miR129)在胃管状腺瘤、胃癌组织及其对应的癌旁组织中的表达及其临床意义。方法收集经高年资病理医师确诊的55例管状腺瘤、76例胃腺癌组织及对应的癌旁组织，分别用原位杂交方法检测miR129的表达，分析miR129表达与临床病理参数之间的关系。结果癌旁胃黏膜组织中miR-129的表达阳性率高于胃管状腺瘤组织，胃管状腺瘤组织中miR-129的表达阳性率高于胃腺癌组织(P<0.05)。miR129在高分化胃癌组织中阳性表达率高于中、低分化组织(P<0.05)；临床分期Ⅰ期中的阳性表达率高于Ⅲ期;无淋巴结转移组织中的表达阳性率高于有淋巴结转移组织(P<0.05)；胃管状腺癌中miR129阳性率高于弥漫型腺癌(P<0.05)。结论miR129在胃腺癌组织内低表达，发挥着抑癌基因的作用；miR129可作为胃腺癌的判断预后的标志物。

【关键词】病理学；腺癌；原位杂交；miR-129；抑癌基因

doi:10.3969/j.issn.1002-7386.2015.20.005

【中图分类号】R 735.2

收稿日期：(2015-03-10)

Expression and clinical significance of miR129 in gastric adenocarcinomaMOUShibin*,MOUYun,GAOFeng.*People’sHospitalofLinxiCounty,Hebei,Linxi054900,China

Abstract【】ObjectiveTo investigate the expression and clinical significance of microRNA129 (miR129) in gastric tubular adenoma tissues,gastric adenocarcinoma tissues and corresponding para-carcinoma tissues.MethodsFifty-five cases of gastric tubular adenoma, 76 cases of gastric adenocarcinoma and corresponding para-carcinoma tissues that were identified by senior pathology doctors were enrolled in the study. The expression levels of miR-129 were detected by in situ hybrization,and the correlation between miR129 expression and clinicopathological parameters was analyzed.ResultsThe positive expression rate of miR-129 in para-carcinoma gastric mucosa tissues was significantly higher than that in gastric tubular adenoma tissues,moreover, which in gastric tubular adenoma tissues was significantly higher than that in gastric adenocarcinoma tissues (P<0.05). The positive expression rate in well differentiated gastric cancer tissues was significantly higher than that in moderately differentiated and poorly differentiated tissues (P<0.05). The positive expression rate of miR-129 in stageⅠcarcinoma tissues was obviously higher than that in stage Ⅲ carcinoma tissues,furthermore, which in carcinoma tissues without lymphonode metastasis was significantly higher than that in carcinoma tissues with lymphonode metastasis (P<0.05). The positive expression rate of miR-129 in gastric tubular adenoma was significantly higher than that in diffuse type adenocarcinoma (P<0.05).ConclusionThe expression levels of miR129 are down-regulated in gastric adenocarcinoma,which may play a role of anti-oncogene,thus miR-129 may be regarded as a marker for evaluating the prognosis of patients with gastric adenocarcinoma.

【Key words】pathology;adenocarcinoma;hybridization in situ;miR-129;anti-oncogene

胃癌是人类常见的恶性肿瘤之一，在国内较为常见，且病死率高。它位居恶性肿瘤死亡的首位,由于胃癌往往没有特征性的症状及体征，许多胃癌患者确诊时往往已经处于中晚期[1]，贻误了最佳治疗时机，所以寻找胃癌的标志物是非常必要的。MicroRNA是一类约22个核苷酸组成的非编码RNA，通过与mRNA的3’URT结合而使其降解或翻译受阻[2]，进而在转录后水平抑制靶基因的表达，研究显示miRNA在多种人类肿瘤中表达紊乱[3]，并参与肿瘤的发生、发展及转移[4-6]。

1资料与方法

1.1一般资料收集2005至2013年在临西县人民医院经手术切除的胃癌标本76例，癌肿原发病灶最大直径2.0～5.0 cm，并选取每个病例中对应的癌旁正常胃黏膜(距离癌灶>5 cm)作为对照，另选取胃黏膜管状腺瘤标本55例，所选标本均采用甲醛固定，石蜡包埋，按照WHO分级标准分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三级，分期采用TNM分期系统分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期。所选76例中男40例，女36例；平均年龄48岁。患者性别、年龄、分级、分期，淋巴结转移情况及Laurens分型是通过复习患者病理记录底单而获得。

1.2主要试剂miR129互补(其碱基序列为5’-AAGTGACTGAAACGTAGCCT-3’)探针，poly d(T)阳性对照探针及miR129正义阴性对照探针均购于北京金萨卜生物科技公司，胃蛋白酶K、杂交液及NBT/BCIP显色液均购于北京中杉金桥公司。

1.3原位杂交(1)贴附有胃癌及癌旁组织的石蜡切片二甲苯脱蜡、梯度酒精水化。(2)用胃蛋白酶室温消化90～120 s以暴露RNA的核酸片段。(3)切片滴加20 μl预杂交液40℃ 恒温处理3 h。(4)每张切片滴加20 μl稀释探针，盖上盖玻片42℃杂交过夜。(5)揭掉盖玻片，室温下，用SSC洗涤3次，滴加封闭液。(6)滴加生物素化鼠抗地高辛，37℃ 处理1 h，洗涤。(7)滴加SABC 37℃ 处理20 min,0.5 mol/L PBS冲洗。(8)玻片滴加生物素化过氧化物酶37℃ 20 min,PBS冲洗。(9)用NBT/BCIP显色试剂在玻片上染色。

1.4结果判定标准原位杂交切片以胞浆或胞核内出现黄色或棕黄色颗粒为阳性表达判定标准，每张切片在显微镜下随机选取10个视野，每个视野均计数100个细胞，结合表达情况应用改进的双评分半定量法评分：阳性细胞数0计为0分，1%～25%计为1分，26%～50%计为2分，51%～75%计为3分，76%～100%计为4分；细胞着色强度:细胞未着色计为0分，淡黄色计为1分，黄棕色计为2分，棕色计为3分。二种计分相乘，得分0～3分作为阴性(-)表达，4～12分计为阳性(+)表达。

1.5统计学分析应用SPSS 15.0统计软件，计数资料采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1癌旁胃黏膜、胃管状腺瘤及原发性胃腺癌中miR-129的表达在癌旁胃黏膜、胃管状腺瘤及原发性胃腺癌中miR129表达的阳性率为94.7%、83.6%、75.0%，其阳性程度随着病变程度的加深而减低(P<0.05)，且不同组别之间差异有统计学意义(P<0.05)。见表1，图1～5。

表1　miR129在不同胃组织中的表达　例(%)

图1miR129在癌旁胃黏膜中呈强阳性表达(DAB显色,×200)

图2miR129在胃腺瘤中呈较强阳性表达(DAB显色,×200)

2.2胃腺癌中miR129的表达与临床病理参数之间的关系miR-129在WHO分化Ⅰ级比WHOⅡ级中的表达阳性率高，在WHOⅡ级比WHOⅢ级中阳性率高;miR-129在Ⅰ期中的阳性率比Ⅱ期中高，在Ⅱ期比Ⅲ期高;miR-129在无淋巴结转移组中的阳性率比有淋巴结转移组中高；miR129在胃肠型腺癌中的阳性率高于弥漫型腺癌，以上差异均有统计学意义(P<0.05)。不同性别、年龄组患者胃腺癌组织中miR-129的表达差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

图3miR129在高分化胃腺癌中呈阳性表达(DAB显色,×400)

图4miR129在中分化腺癌中呈弱阳性表达(DAB显色,×400)

图5miR129在低分化胃腺癌中极弱阳性表达(DAB显色,×400)

表2　临床病理参数与miR129表达之间的关系　例(%)

3讨论

最近十余年来，越来越多的证据表明miRNA参与了包括癌症在内的人类疾病的发病过程。据报道，在一些癌症中存在着miR129的异常表达，并直接涉及了癌症的发生、浸润及转移等过程[7-9]。这些资料提示miR-129在多种癌症中起着不同的作用，但是对胃癌患者中miR129的表达与胃癌患者预后之间的关系还知之甚少。本研究侧重于miR129的表达水平与胃癌各种临床病理参数之间潜在的关系。由于miRNA在甲醛固定的标本中能得到较好的保存，这就是使其在常规的组织研究中成为富有价值的研究对象[10]。以前的研究多采用RT-PCR方法揭示了miR-129与胶质母细胞瘤的预后较差明显相关[11]。这些关于miRNA临床预后的研究都是通过提取癌组织蜡块中RNA并采用qRT-PCR方法来实现的。癌组织块中既包含实质性肿瘤细胞，又包含肿瘤相关间质细胞，所以采用从整体癌组织中的RNA提取物进行实验很可能会产生错误的结果。近来资料显示在肿瘤间质细胞中也存在microRNA的高表达[12]。原位杂交的主要优点是能在细胞水平上精确检测阳性信号。

经过本次研究，我们发现miR129表达于良性胃黏膜上皮细胞的胞浆之中，在胃癌细胞中的表达则明显降低；并且miR129的表达随着胃癌分级、分期的加重及淋巴结转移的出现而降低；miR-129在肠型腺癌中的表达高于弥漫型腺癌。有研究报道，miR-129在结肠癌[13，14]及肝癌[15]中表达降低，并且miR129的表达降低与结肠癌的临床分期及演进明显正相关[13]，这与本研究的结果相一致。有人报道结肠癌中的miR129的表达降低是由于miR-129基因启动子的高甲基化引起的[15]。最近几年的研究结果显示在子宫内膜癌中miR-129的作用的靶标是SOX4基因，由于miR129启动子的甲基化导致miR-129的表达的降低，从而导致在癌变过程中SOX4的表达升高[16]，类似的结果也见于食管癌及肝细胞肝癌[17，18]。在上述癌症中SOX4基因的高表达在癌症演进及转移过程中起着非常重要的作用[19]。除了SOX4，最近的研究表明在结肠癌中miR-129通过抑制Bcl-2的表达而发挥调节癌细胞凋亡的关键作用[20]，miR-129还通过抑制E2F3的表达而影响细胞周期。目前充足的证据表明miR-129的表达缺失与结肠癌，肝癌及胃癌等恶性肿瘤的演进密切相关，所以miR-129能作为胃癌等恶性肿瘤的预后因子。

由于miRNA不但能在甲醛固定石蜡包埋的组织中而且能在细胞外稳定存在，所以可以作为通过抽血而测定的具有可重复性的生物标记物[21]，因此检测miR-129可能作为胃癌的无创性的重要辅助诊断工具；通过检测胃液中的miR-129的浓度还能判断胃癌的预后[22]。

总之，我们的实验结果显示miR129在胃癌发生发展中发挥着抑癌基因的作用，miR-129的表达下调预示着胃癌预后较差。miR-129有望成为判断胃癌预后的重要手段。

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