MicroRNA-34c在人脑胶质瘤中的表达及临床意义

论著

MicroRNA-34c在人脑胶质瘤中的表达及临床意义

武震东任洪波孙志强刘斌张素兰焦保华

项目来源：河北省医学科学研究重点课题(编号：ZD20140280)

作者单位： 050000石家庄市，河北医科大学第二医院神经外科[武震东(现工作单位为河北省邯郸市中心医院神经外科)、焦保华]；河北省邯郸市中心医院神经外科(任洪波、孙志强、刘斌、张素兰)

E-mail：jiaobh2000@163.com

【摘要】目的探讨miRNA-34c在人脑胶质瘤组织中的表达情况及临床意义。方法应用定量PCR方法对18例WHO分级Ⅱ～Ⅳ级的甲醛固定石蜡包埋的脑胶质瘤标本和外伤或脑出血患者内减压手术获得的5例脑组织标本分别进行miR-34c-3p和miR-34c-5p含量的检测，比较不同级别胶质瘤和正常脑组织中miR-34c-3p和miR-34c-5p的表达差异，分析miR-34c-3p和miR-34c-5p的表达和胶质瘤恶性程度的相关性。结果与正常脑组织相比，胶质瘤中miR-34c-3p和miR-34c-5p的表达皆显著减少(P<0.05)，而且miR-34c-3p和miR-34c-5p的表达随着胶质瘤级别或恶性程度的增加分别减少，呈显著的负相关(miR-34c-3p的spearman相关系数=-0.856，P<0.01；miR-34c-5p的spearman相关系数=-0.767，P<0.01)。结论MiR-34c在人脑胶质瘤细胞中的表达显著降低，而且表达随着肿瘤分级或恶性程度的增高而减少，与胶质瘤级别的升高呈显著的负相关。MiR-34c在胶质瘤的进展中有重要的意义，可作为脑胶质瘤临床分级的重要指标。

【关键词】胶质瘤；microRNA；miR-34c-3p；miR-34c-5p

doi:10.3969/j.issn.1002-7386.2015.20.003

通讯作者：焦保华，050000河北医科大学第二医院神经外科；

【中图分类号】R 739.4

收稿日期：(2005-03-11)

The expression and clinical significance of miRNA-34c in human brain glioma tissuesWUZhendong*,RENHongbo,SUNZhiqiang,etal.*DepartmentofNeurosurgery,TheSecondHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050000,China

Abstract【】ObjectiveTo investigate the expression and clinical significance of miRNA-34c in human brain glioma tissues.MethodsThe expression levels of miR-34c-3p and miR-34c -5p in 18 brain glioma specimens at WHO grade Ⅱ～Ⅳ class and 5 specimens got from patients with trauma or cerebral hemorrhage were detected by quantitative PCR. Moreover the differences of expression levels of miR-34c-3p and miR-34c -5p between different grade gliomas and normal brain tissue were compared,and the correlation between the expressions of miR-34c-3p, miR-34c-5p and malignant degree of gliomas was analyzed.ResultsAs compared with those in normal brain tissue,the expression levels of miR-34c-3p and miR-34c-5p in gliomas were significantly decreased (P<0.05),moreover, there was a significant negative correlation between expressions of miR-34c-3p,miR-34c-5p and malignant degree or grade of gliomas (r=-0.856,r=-0.767,respectively,P<0.01).ConclusionThe expression levels of miRNA-34c are significantly decreased in human brain glioma cells,moreover, there is a significant negative correlation between expressions of miR-34c-3p , miR-34c-5p and malignant degree or grade of tumor. MiRNA-34c plays an important role in the development of glioma,thus it can be regarded as an important index for clinical classification of brain glioma.

【Key words】glioma；microRNA；miR-34c-3p；miR-34c-5p

神经胶质瘤是中枢神经系统最为常见的恶性肿瘤，也是最难治疗的肿瘤之一。常规的临床治疗方法如化疗、手术切除和放疗效果欠佳[1]，而胶质瘤组织的浸润性生长却常常使患者在出现症状后很快面临肿瘤转移而导致死亡的威胁，目前从基因水平寻找恶性胶质瘤防治的新途径成为研究的热点。MicroRNAs(miRNAs)是一种约22个核苷酸长度非编码单链小RNA，其本身不具有翻译蛋白质的功能, 而是通过与mRNA 的3’端非翻译区(3’UTR)的碱基序列互补配对在转录后水平调控靶基因表达。MiRNA与mRNA能进行完全或近乎完全的互补配对，诱导对mRNA 的切割降解，而部分碱基配对则导致功能蛋白质的转录抑制[2]。MiRNAs能参与一系列重要的生物学行为, 例如细胞分化、细胞增殖与凋亡、应激反应等[3]。同时显示出miRNAs与癌症的形成关系密切，原因是它参与了细胞的增殖、凋亡，这两个与人类恶性肿瘤的发生、进展密切相关的两个进程。亦有报道与正常组织比较，恶性肿瘤组织的miRNAs异常表达[4]。本实验主要研究microRNA-34c在胶质瘤组织和细胞系中的表达情况。

1资料与方法

1.1一般资料胶质瘤组织标本和正常脑组织标本均来自于河北医科大学第二医院神经外科。共收集2011年1至6月期间甲醛固定石蜡包埋的脑胶质瘤标本18例，正常脑组织标本5例。所有标本病理结果均经病理科证实，根据WHO的病理分级标准，分为Ⅱ～Ⅳ级，其中Ⅱ级胶质瘤共6例，包括星形细胞瘤2例、室管膜瘤2例、少突胶质细胞瘤2例。Ⅲ级胶质瘤6例，其中间变性星形细胞瘤4例、间变性少突胶质细胞瘤2例。Ⅳ级胶质瘤6例，均为多形性胶质母细胞瘤。脑出血、脑外伤患者行内减压手术而得到的正常脑组织5例作为对照组。

1.2实验方法利用Trizol(Invitrogen， USA)提取胶质瘤组织及正常脑组织总RNA。取1 μg总RNA做stem-loop引物的逆转录反应。miR-34c-3p和 miR-34c-5p的共同逆转录引物为：miRNA R：5’CTCAACTGGTGTCGTGGA；PCR引物为：hsa-miR-34c-3p F：5’ACACTCCAGCTGGGAATCACTAACCACACGG；hsa-miR-34c-5p F：5’ACACTCCAGCTGGGAGGCAGTGTAGTTAGCTGAT；内参U6的引物为：U6-F：5’CTCGCTTCGGCAGCACA；U6-R：5’AACGCTTCACGAATTTGCGT。所有引物均为上海生工合成。使用的定量PCR仪为ABI PRISMR 7500 Sequence Detection System。PCR扩增程序如下：95℃变形5 min，随后95℃作用15 s，65℃作用15 s，72℃作用32 s，共进行40个循环，在温度60℃～95℃进行融解曲线分析，每个样本重复3次。

1.3统计学分析以U6做为内参，以2-ΔΔCT表示各种miRNA的相对表达量，应用SPSS 16.0统计软件，定量PCR采用ANOVA单因素方差分析，miR-34c-3p、miR-34c-5p与病理分级的相关性采用Spearman等级相关分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1MiR-34c在人脑胶质瘤中的表达情况定量PCR检测结果显示，在18份人脑胶质瘤标本中，miR-34c-3p和miR-34c-5p稳定表达。在经过和U6内参相比较，以正常脑组织全RNA作为对照，正常脑组织中miR-34c-3p和miR-34c-5p的水平分别是WHO Ⅱ级胶质瘤标本的1.84倍和7.3倍；分别是WHO Ⅲ级胶质瘤标本的7.8倍和26.1倍；分别是WHO Ⅳ级胶质瘤标本的49.6倍和208.8倍；差异均有统计学意义(P<0.05)。见图1。

图1实时定量PCR检测人脑胶质瘤中miRNA-34c的表达；与对照组比较，*P<0.05

2.2MiR-34c在胶质瘤中表达与病理分级相关性分析我们用Spearman等级相关分析分析了miR-34c-3p和miR-34c-5p在胶质瘤中表达的相关性，发现其表达和胶质瘤标本WHO病理分级存在负相关性(r=-0.856和-0.767，P<0.01)。见图2。

图2miRNA-34c-3p和miRNA-34c-5p在不同级别胶质瘤中的表达及其与肿瘤恶性程度的相关性

3讨论

miRNAs是一种约22个核苷酸长度非编码单链小RNA，其本身不具有翻译蛋白质的功能,而是通过与mRNA的3’端非翻译区(3’UTR)的碱基序列互补配对在转录后水平调控靶基因表达。最近有文章报道miRNAs与肿瘤的关系，特别是与肿瘤恶性度及肿瘤病人的预后有密切关系[5]。

miRNA-34家族由miR-34a,miR-34b and miR-34c组成，并且在不同的物种中具有高度的保守性[6]。最近有报道miR-34a-c是肿瘤抑制因子p53的直接转录靶点，参与p53和Notch信号通路的调控，具有肿瘤抑制的特性[7]。已有报道miR-34c在许多不同的恶性肿瘤中低表达，但是miR-34c在胶质瘤临床标本中的表达情况如何，以及它潜在的可能抑制肿瘤生长的作用还不得而知，miR-34c有两个成熟的单链，miRNA-34c-3p和miRNA-34c-5p[8]。曾有报道，组织中miRNAs的表达水平不受甲醛固定石蜡包埋的影响[9,10]，因此，我们试图检测在人脑胶质瘤石蜡标本中miRNA-34c-3p和miRNA-34c-5p的表达水平。

本实验采用定量PCR的方法分析了18例甲醛固定石蜡包埋的人脑胶质瘤和5例正常脑组织miRNA-34c-3p和miRNA-34c-5p的表达，试图发现miRNA-34c-3p和miRNA-34c-5p在人脑胶质瘤的表达与胶质瘤恶性程度之间的关系。经统计学分析我们发现，人脑胶质瘤中miRNA-34c-3p和miRNA-34c-5p的表达显著低于正常脑组织(P<0.05)，这说明miRNA-34c-3p和miRNA-34c-5p能与人脑胶质瘤的发生、发展密切相关，在其中发挥重要的生物学作用。另外人脑胶质瘤Ⅱ～Ⅳ级中miRNA-34c-3p和miRNA-34c-5p的表达存在差异，随胶质瘤级别的增高组织中miRNA-34c-3p和miRNA-34c-5p的表达显著降低，相关性统计表明miRNA-34c-3p和miRNA-34c-5p的表达水平与人脑胶质瘤的病理级别显著相关，与人脑胶质瘤的恶性程度负相关。胶质瘤发生时，miRNA-34c-3p和miRNA-34c-5p的表达受到抑制，且随着胶质瘤恶性程度的加大，miRNA-34c-3p和miRNA-34c-5p受抑制程度加大。因此我们推断miRNA-34c-3p和miRNA-34c-5p可能在胶质瘤的发生发展中起到一定作用。

参考文献

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2Nelson KM,Weiss GJ. MicroRNAs and cancer: past, present, and potential future. Molecular cancer therapeutics,2008,7: 3655-3660.

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