E2F1及EGR-1在肾透明细胞癌中的表达及意义

论著

E2F1及EGR-1在肾透明细胞癌中的表达及意义

丁家宝王亚轩李景东高栩王志胜郭绍卫滕志海韩振伟常学良黎玮

作者单位： 050000石家庄市，河北医科大学第二医院泌尿外科

E-mail:wangyaxuan87@126.com

【摘要】目的探讨转录因子E2F1、早期生长反应基因-1(EGR-1)在人肾透明细胞癌(RCCC)组织中的表达及临床意义。方法采用免疫组织化学方法检测48例RCCC、28例癌旁肾组织中E2F1和EGR-1蛋白的表达情况。分析E2F1和EGR-1与患者临床病理特征的关系。RT-PCR方法检测34例RCCC、15例癌旁肾组织中E2F1和EGR-1的mRNA表达情况。结果免疫组织化学方法显示:E2F1在RCCC组织中阳性表达率为明显高于癌旁肾组织(P<0.05)。EGR-1在RCCC组织中的阳性表达率明显高于癌旁肾组织(P<0.05)；E2F1与EGR-1蛋白在RCCC中的表达呈正相关(r=0.533，P<0.01)，与患者性别、年龄无关(P>0.05)，而与RCCC组织学分级及临床分期有关(P<0.05)。RT-PCR方法显示：E2F1在RCCC组织和癌旁肾组织中积分吸光度比值比较，差异有统计学意义(P<0.05)。EGR-1在RCCC组织和癌旁肾组织中积分吸光度比值比较，差异有统计学意义(P<0.05)。结论在RCCC组织中，高表达的E2F1和EGR-1可能与RCCC的发生、发展及浸润转移密切相关。

【关键词】E2F1;EGR-1;肾细胞癌;RT-PCR;免疫组化

doi:10.3969/j.issn.1002-7386.2015.20.001

通讯作者：王亚轩，050000石家庄市，河北医科大学第二医院泌尿外科;

【中图分类号】R 737.11

收稿日期：(2015-03-09)

The expression and significance of E2F1 and EGR-1 in renal clear cell carcinomaDINGJiabao,WANGYaxuan,LIJingdong,etal.DepartmentofUrology,TheSecondHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050000,China

Abstract【】ObjectiveTo investigate the expression and clinical significance of E2F1 and EGR-1 in renal clear cell carcinoma (RCCC).MethodsImmunohistochemistry was used to detect the expression levels of E2F1 protein and EGR-1 protein in 48 cases of RCCC tissue and 28 cases of cancer adjacent tissues.The correlation between the expressions of E2F1, EGR-1and clinicopathological characteristics of RCCC was analyzed. RT-PCR was used to detect the expression levels of E2F1 and EGR-1mRNA in 34 cases of RCCC tissues and 15 cases of cancer adjacent tissues.ResultsImmunohistochemistry results showed that the positive expression rate of E2F1 in RCCC tissues was significantly higher than that in cancer adjacent tissues (75% vs 32.1%, P<0.05). The positive expression rate of EGR-1 in RCCC tissues was significantly higher than that in cancer adjacent tissues (79.2% vs 35.7%,P<0.05). The expression of E2F1 was positively correlated to that of EGR-1 protein in RCCC tissues (r=0.533,P<0.01),which was not related with patient’s sex and age (P>0.05),however,which was closely correlated to histological grade and clinical stage of RCCC (P<0.05). RT-PCR results showed that there was a significant difference in the integral absorbance ratio of E2F1 between RCCC tissues and cancer adjacent tissues (0.2628±0.0656 vs 0.1225±0.0237,P<0.05),moreover, there was a significant difference in the integral absorbance ratio of EGR-1 between RCCC tissues and cancer adjacent tissues (0.2788±0.0893 vs 0.1279±0.02660,P<0.05).ConclusionThe high expressions of E2F1 and EGR-1 in RCCC may be closely correlated to the pathogenesis, development,infiltration and metastasis of RCCC.

【Key words】 E2F1;EGR-1; renal cell carcinoma;RT-PCR; immunohistochemistry

肾细胞癌占成人恶性肿瘤的2%～3%，其中肾透明细胞癌(renal clear cell carcinoma，RCCC)是肾细胞癌中最常见的恶性肿瘤[1]。25%患者就诊时已转移，并且转移性肾癌患者对放化疗均不敏感，免疫治疗和分子靶向治疗[2]有效率也较低。本文旨在研究E2F1、早期生长反应基因-1(EGR-1)在肾透明细胞癌组织中的表达，为RCCC的治疗提供新靶点。

1资料与方法

1.1一般资料收集2013年4月至2014年8月河北医科大学第二医院泌尿外科手术患者的肾透明细胞癌组织标本48例(经病理学证实)，其中男31例，女17例；年龄45～76岁。同时选取28例癌旁正常肾组织(为癌旁4 cm以外肾组织，经病理学证实)。根据1997年Fuhrman分级进行病理组织分级，高分化10例，中分化19例，低分化19例；根据国际2010年AJCC肾癌 TNM分期标准进行临床分期：Ⅰ期10例、Ⅱ期18例、Ⅲ期16例和Ⅳ期4例。手术前所有患者均未行放疗、化疗、细胞因子及靶向等治疗。所有标本分为两份，一份经10%的中性缓冲甲醛溶液固定，石蜡包埋，4 μm厚连续切片；另一份置于-80℃冰箱中保存。

1.2实验试剂及仪器鼠E2F1单克隆抗体购自于美国Santa Cruz Biotechnology公司，鼠EGR-1单克隆抗体购自于美国Santa Cruz Biotechnology公司，琼脂糖购自于西班牙公司，PCR反应体系、cDNA Synthesis Kit、RNAiso Plus、DL2000 DNA Marker均购自于Takara公司，ABC免疫组化试剂盒购自于Vector Laboratories公司。E2F1上游引物为：5'-CTACGTGACGTGTCAGGACC-3'；下游引物为：5'-GGTGGGGAAAGGCTGATGAA-3'；EGR-1上游引物为：5'-CCCGTTCGGATCCTTTCCTC-3'；下游引物为：5'-GCGGCCAGTATAGGTGATGG-3'；内参GAPDH上游引物为：5'-GACCACAGTCCATGCCATCA-3'；下游引物为： 5'-GAGATTCAGTGTGGTGGGGG-3 '。

1.3方法

1.3.1免疫组织化学方法:将实验标本切片常规脱蜡后，严格按照试剂盒说明书进行操作，最后复染，脱水封片，以PBS液替代一抗作阴性对照。

1.3.2RT-PCR:应用Trizol法在加入RNAiso Plus的溶液中提取组织总RNA，紫外分光光度计260、280 nm及320 nm处读取OD值，然后测定RNA的纯度及含量。逆转录反应依照大连Takara公司cDNA合成试剂盒说明书操作。将逆转录产物在美国PE基因扩增仪中进行PCR反应。将扩增产物放于含GV核酸染料的琼脂糖凝胶电泳，以DNA Marker(DL2000)作为标准片段标记，电泳后经紫外透射仪观察、数码相机照相以及采用Quantity One凝胶图象分析软件对目的电泳条带分析后，以相应的内参电泳条带作为参照，最后采用两者积分吸光度比值表示结果。

1.3.3结果评定:免疫组化结果判定方法：染色强度分数标准：无色为0分；淡黄色为1分；棕黄色为2分；棕褐色为3分。高倍镜下随机观察5个视野，应用双盲半定量法取阳性细胞占计数细胞百分率，百分率≤9%为0分；10%～29%为1分；30%～49%为2分；50%～75%为3分；>75%为4分。总分取染色强度分数与阳性细胞染色百分率分数的乘积，总分:0～3分为阴性，4～7分为阳性，8～12分为强阳性。

1.4统计学分析应用SPSS 13.0统计软件，比较肾透明细胞癌及癌旁正常肾组织中E2F1及EGR-1蛋白阳性表达率之间的差异，分析二者阳性表达率与临床病理特征的关系，应用χ2检验或Fisher确切概率法检验；E2F1与EGR-1相关关系采用Spearman等级相关分析；E2F1和EGR-1的积分吸光度比值以表示，采用t检验进行组间比较，P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1免疫组织化学染色结果显示E2F1蛋白表达主要分布于细胞核中，在RCCC组织中阳性表达率为75%(36/48)，明显高于癌旁组32.1%(9/28)(P<0.05)。EGR-1蛋白表达主要分布于细胞核中，在RCCC组织中阳性表达率为79.2%(38/48)，明显高于癌旁组35.7%(10/28)(P<0.05)。两者在48例RCCC中的表达具有正相关性(r=0.533，P<0.01)。E2F1在48例RCCC组织中的表达，在Ⅲ～Ⅳ期中的表达高于在Ⅰ～Ⅱ期中的表达(r=0.390，P<0.01)，在低分化组中的表达高于在中、高分化组中的表达(r=0.369，P<0.05)。EGR-1在48例RCCC组织中的表达，在Ⅲ～Ⅳ期中的表达高于在Ⅰ～Ⅱ期中的表达(r=0.330，P<0.05)，在低分化组中的表达高于在中、高分化组中的表达(r=0.415，P<0.01)。在RCCC中E2F1、EGR-1的表达与患者性别、年龄无关(P>0.05)。见表1～3,图1～2。

表1　E2F1与EGR-1蛋白表达的关系　例

表2　RCCC患者E2F1蛋白与临床病理特征的关系　例

表3　RCCC患者EGR-1蛋白与临床病理特征的关系　例

2.2RT-PCR结果显示E2F1在癌旁正常肾及RCCC组织中的mRNA相对表达量分别为(0.1225±0.0237)、(0.2628±0.0656)，肾癌组明显高于癌旁组(P<0.05)；EGR-1在癌旁正常肾及RCCC组织中的

图1　不同组织中E2F1的表达(SP×400)

图2　不同组织中EGR-1的表达(SP×400)

mRNA相对表达量分别为(0.1279±0.0266)、(0.2788±0.0893)，肾癌组明显高于癌旁组(P<0.05)。见图3。

图3RT-PCR肾癌及癌旁正常肾组织中的表达；1～7：肾癌组织，8～13：癌旁正常肾组织

3　讨论

我国肾癌人群呈逐年上升趋势，侵袭与转移是患者死亡的主要原因，针对转移性肾癌的术后辅助治疗，不能明显提高患者生存率[3]。因此，我们希望探索肾癌的发病机制，进一步寻找肾癌治疗的新途径。

转录因子E2F1属于细胞周期调控因子E2F家族中重要成员之一，与视网膜母细胞瘤蛋白(Rb蛋白)以异二聚体形式结合成稳定的复合物。在慢性炎症或病毒感染等外界刺激下，cyclin-cdk-Rb通道被激活，释放出游离的E2F1，被释放的E2F1通过调控细胞周期G1→S期的转变来控制细胞的增殖[4]，而G1→S期的转变失调，是正常细胞转变成为肿瘤细胞的最关键环节。高表达的E2F1能够促使细胞过度增殖并向恶性转化，如在结肠癌中E2F1表达明显增高，且与肿瘤分级分期及远处转移等密切相关[5]。另外，有研究表明，肾细胞癌中E2F1在蛋白及基因水平表达均明显上调，应用回归分析显示E2F1可作为肾癌的预后指标，E2F1表达水平越高，肾癌患者预后越差[6]。

EGR-1不仅在细胞生长及分化中具有重要作用[7]，而且在肿瘤的发生发展中也扮演重要角色。EGR-1在许多肿瘤中表达上调，并且可能作为预后指标，通过测定EGR-1表达可能有助于评估胃癌患者的预后情况[8]。Tian等[9]发现，以EGR-1为接入点，在鼻咽癌细胞系中敲低EGR-1表达水平，肝细胞生长因子(HGF)表达减少，同时单克隆抗体(SAIT301)标记甲硫氨酸的活性降低，联合EGR-1和SAIT301可能成为治疗鼻咽癌的一种新工具。但EGR-1在肾癌中的表达尚无有关报道。

本实验结果显示，E2F1、EGR-1蛋白及mRNA水平在肾癌组织表达均明显高于在癌旁正常肾组织中的表达。E2F1、EGR-1表达与患者性别、年龄无关，与临床分期及病理分级密切相关，且二者存在正相关关系。提示二者在RCCC的发生、发展及转移过程中具有重要地位。有研究表明，E2F1、EGR-1在前列腺癌组织中呈高表达，且存在正相关关系，考虑高表达的E2F1可能通过NF-κB信号通路促进EGR-1的表达，继而影响肿瘤的发生及发展[10]。E2F1、EGR-1在前列腺癌及RCCC中的表达情况相似，因此我们推测，在静止细胞中，转录因子NF-κB蛋白通过N端高度保守的结构域与人核因子kB抑制蛋白(IkB)相结合形成NF-KB:IκB复合物，使NF-κB的核定位信号(NLS)被掩盖，停留在胞浆内处于非激活状态[11]。在RCCC组织中，如果内环境出现改变，通过NF-κB经典与非经典信号通路，IkB被降解，NF-κB被释放进入核内，高表达的E2F1与NF-κB蛋白相结合，增强NF-kB对EGR-1转录的调节能力，高表达的E2F1及EGR-1影响RCCC的发生及发展。通过对E2F1、EGR-1研究的不断深入，希望能为今后RCCC的治疗，提供新的介入点。

综上所述并推测，E2F1、EGR-1在RCCC组织中的表达均明显高于癌旁正常肾组织，并且二者存在正相关关系，推测二者在RCCC的发生、发展中起到相互协同的作用；联系并针对二者对RCCC的生物学效应，希望能为RCCC临床治疗提供新靶点；在临床病理活检中检测二者基因蛋白的表达，可能对RCCC患者预后的评估有一定意义。但是由于本实验的样本数较少，有待更多相关研究去验证。

参考文献

1Tanriverdi O.Review on targeted treatment of patients withadvanced-stage renal cell carcinoma:a medical oncologists perspective.Asian Pac J Cancer Prev,2013，14:609-617.

2Creel PA. Optimizing patient adherence to targeted therapies in renal cell carcinoma. Clin J Oncol Nurs，2014,18:694-700.

3Park YH,Jung JW,Lee BK，et al．Targeted therapy after complete resection of metastatic lesions in metastatic renal cell carcinoma.Int J Urol,2014 Nov 25.

4Muller H,Bracken AR,Vernell R,et al. E2Fs regulate the expression of genes involved in differentiation,development,proliferation,and apoptosis.Genes Dev,2001,15:267-285.

5Iwamoto M,Banerjee D,Menon LG,et al. Overexpression of E2F-1 in lung and liver metastases of human colon cancer is associated with gene amplification.Cancer Biol Ther,2004,3:395-399.

6Mans DA1,Vermaat JS,Weijts BG,et al.Regulation of E2F1 by the von Hippel-Lindau tumour suppressor protein predicts survival in renal cell cancer patients.J Pathol,2013,231:117-129.

7Alagappan D,Balan M,Jiang Y,et al．Egr-1 is a critical regulator of EGF-receptor-mediated expansion of subventricular zone neural stem cells and progenitors during recovery from hypoxia-hypoglycemia.ASN Neuro,2013,5:183-193.

8Myung E,Park YL,Kim N，et al．Expression of early growth response-1 in human gastric cancer and its relationship with tumor cell behaviors and prognosis.Pathol Res Pract,2013,209:692-699.

9Tian H,Ge C,Li H，et al．Ribonucleotide reductase M2B inhibits cell migration and spreading by early growth response protein 1-mediated phosphatase and tensin homolog/Akt1 pathway in hepatocellular carcinoma.Hepatology,2014,59:1459-1470.

10Zheng C,Ren Z,Wang H，et al．E2F1 Induces tumor cell survival via nuclear factor-kappaB-dependent induction of EGR1 transcription in prostate cancer cells.Cancer Res,2009,69:2324-2331.

11Zhou L,Yeo A,Ballarano C，et al．Disulfide-Mediated Stabilization of the IκB Kinase Binding Domain of NF-κB Essential Modulator (NEMO).Biochemistry,2014,