九龙藤总黄酮调控自噬对抗心肌缺血/再灌注损伤的实验研究

孙　瑶，张　婵，简　洁

(桂林医学院药学院，广西 桂林　541004)

九龙藤总黄酮调控自噬对抗心肌缺血/再灌注损伤的实验研究

孙瑶，张婵，简洁

(桂林医学院药学院，广西 桂林541004)

中国图书分类号：R-332；R284.1；R329.24；R329.411；R542.2；R619.9

摘要：目的研究九龙藤总黄酮(Bauhinia championii flavones, BCF)调控自噬抗心肌缺血/再灌注损伤的作用。方法120只SD大鼠随机分为假手术组、模型组、BCF高剂量组、BCF低剂量组、自噬抑制剂(3-MA)组(n=8)，采用左冠状动脉前降支结扎法制备大鼠心肌缺血/再灌注模型，以紫外分光光度法检测缺血30min、缺血/再灌注1 h及3 h时肌酸激酶同工酶(CK-MB)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、总抗氧化力(T-AOC)的含量；以Western blot法检测心肌微管相关蛋白轻链3蛋白-Ⅱ(LC3-Ⅱ)、Beclin-1、雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)的表达。结果与模型组相比，BCF能剂量依赖性提高心肌缺血/再灌注不同时段的T-AOC，降低CK-MB及iNOS含量，下调LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白表达，上调mTOR蛋白表达(P<0.05或P<0.01)；与3-MA组相比，BCF能够降低iNOS及CK-MB，提高T-AOC水平，缺血期上调LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白表达，再灌注期下调LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白表达，缺血/再灌注期均下调mTOR蛋白表达(P<0.05)。结论自噬在心肌缺血期即发生，并随着缺血/再灌注时间延长而进一步加强；BCF预处理可促进缺血期自噬发生及抑制再灌注时自噬过表达，从而减轻心肌缺血/再灌注损伤。

关键词：九龙藤总黄酮；调控；自噬；不同时段；缺血/再灌注损伤；保护作用

自噬是维持心肌细胞形态、结构和功能的关键调节因子，其在心脏疾病调节中具有双刃剑作用[1-2]：既可以延缓疾病进程，促进损伤恢复，也可以导致细胞死亡。Beclin-1介导的自噬/凋亡互反馈信号通路和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)介导的自噬/mTOR互反馈信号通路，是两条经典的自噬信号途径[3]。此外，Bcl-2和NF-κB亦影响自噬的功能[4]：Bcl-2和Beclin-1的平衡状态决定了自噬的作用，Bcl-2表达下调不仅可以诱发凋亡，而且可以通过激活Beclin-1来激活自噬，而激活NF-κB则可通过下调Beclin-1表达抑制自噬、促进凋亡。自噬的发生机制、调控因素及药物干预是目前心脏疾病研究领域的一个热点。

九龙藤(别名过岗龙、过江龙等)为广西特色中草药，属豆科羊蹄甲属植物龙须藤[Bauhiniachampionii(Benth.)Benth.]的干燥藤茎，富含黄酮类成分[5]。课题组前期研究证明[5-7]，九龙藤总黄酮(Bauhiniachampioniiflavones, BCF)能够增加心肌细胞活力；降低LDH、增加ATPase活性，改善心肌代谢；降低iNOS、增加eNOS、减少肌酸激酶同工酶、心肌肌钙蛋白1、肌红蛋白含量，减轻垂体后叶素所致心肌缺血损伤；上调Bcl-2、下调Bax、NF-κB p65蛋白表达、降低TNF-α含量，抑制心肌细胞凋亡，对心肌缺血/再灌注损伤(myocardial ischemia-reperfusion，MIRI)具有明显的保护作用。上述作用涉及多个自噬信号通路靶点如ATPase、TNF-α、NOS、Bcl-2家族、NF-κB等，那么，BCF是否通过抑制凋亡，下调Beclin-1蛋白表达，进而抑制自噬？它对mTOR又有何作用？基于此思路，本文以自噬标志物LC3-Ⅱ，自噬相关蛋白Beclin-1、mTOR为主要指标，探讨BCF预处理对心肌缺血/再灌注不同时段自噬的调控作用，为进一步的新药研发提供实验依据。

1材料

1.1动物SPF级SD大鼠，♂，体质量250～280 g，由桂林医学院实验动物中心提供，许可证：SCXK(桂)2010-0002。

1.2药物与试剂BCF(本室分离纯化，总黄酮含量以芦丁计为82%，用含2%DMSO的生理盐水溶解备用)；自噬抑制剂3-Methyladenine(3-MA，美国Cayman公司，货号：13242)；肌酸激酶同工酶(CK-MB，货号：E006)、总抗氧化力(T-AOC，货号：A015)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS，货号：A014-1)试剂盒均购于南京建成生物工程研究所；LC3-Ⅱ抗体(美国Epitomics公司，货号：ab52768)；mTOR(货号：7C10)、Beclin-1(货号：D40C5)抗体均购于美国CST公司。

1.3主要仪器BL-420F生物机能实验系统(成都泰盟科技有限公司)；小动物呼吸机DW-3000(上海嘉鹏科技有限公司)；Model 1450型自动酶标仪(美国BIORAD公司)；冷冻离心机MikRro220R(美国Beckman公司)；UV2550紫外分光光度计(日本岛津公司)；JY300C电泳仪(北京君意东方电泳设备有限公司)；培清JS-780全自动凝胶成像分析仪(上海培清科技有限公司)。

2方法

2.1动物分组造模及给药将120只SD大鼠随机分为假手术组、模型组、BCF高剂量组(BCFH,20 mg·kg-1)、BCF低剂量(BCFL,10 mg·kg-1)、3-MA组(15 mg·kg-1)(n=8)，各组于造模前10 min舌下静脉给药(假手术组及模型组给予同体积含2%DMSO的生理盐水)，按文献方法[7]建立大鼠心肌缺血(缺血30 min)及缺血/再灌注损伤(缺血30 min再灌注1 h及3 h)模型，以心电图QRS波幅加大，ST段抬高，T波高耸或倒置作为缺血成功与否判断标准；复灌后，上述各指标逐步恢复即为再灌注成功。

2.2指标检测及测定方法

2.2.1血清T-AOC、iNOS及CK-MB含量测定造模结束，各组动物在相应的时间点经腹主动脉取血5 mL，3 000 r·min-1离心10 min，取上清，按试剂盒说明书检测血清T-AOC、iNOS、CK-MB含量。

2.2.2Western blot检测LC3-Ⅱ、Beclin-1、mTOR的蛋白表达各组动物在相应的时间点，取心脏，用预冷的生理盐水充分洗净残血，取部分结扎线以下左心室组织60 mg，滤纸吸干、剪碎、液氮研磨，用RIPA裂解总蛋白并定量，SDS-PAGE电泳，转膜横流90 mA，5%脱脂牛奶封闭2 h，一抗4℃过夜，二抗室温孵育1 h，ECL发光，X线片显影、定影后用SensiAnsys凝胶图像分析系统测其灰度值。

3结果

3.1心电图从Fig 1可见，结扎大鼠冠状动脉左前降支30 min后心电图ST段明显抬高，说明造模成功。BCF预处理可抑制造模后心肌ST段抬高，3-MA对抬高的ST段无影响。

Fig 1Changes of electrocardiogram in each group

3.2血清生化指标检测从Tab 1、2可见，模型组大鼠血清T-AOC明显降低，iNOS及CK-MB明显升高(P<0.05vsSham)；与模型组相比，BCF能增强总抗氧化力，降低iNOS及CK-MB含量，并呈剂量依赖性(P<0.05或P<0.01)；3-MA在缺血期对血清T-AOC、iNOS及CK-MB影响差异无统计学意义(P>0.05)，再灌注期能改善总抗氧化力，在一定程度上降低iNOS及CK-MB含量(P<0.05)。与3-MA组相比，BCF降低血清iNOS及CK-MB含量，提高T-AOC水平(P<0.05)。

3.3心肌组织LC3-Ⅱ、Beclin-1、mTOR蛋白表达与假手术组相比，模型组心肌组织LC3-Ⅱ、Beclin-1及mTOR蛋白表达量增加(P<0.05)。与模型组相比，BCF在缺血/再灌注3个时段均可剂量依赖性地降低LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白表达，提高mTOR蛋白表达(P<0.05或P<0.01)。与3-MA组相比，BCF对缺血期LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白表达上调作用更强；在再灌注期，BCF抑制LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白的表达；BCF在缺血/再灌注期均下调mTOR蛋白表达(P<0.05)。结果见Fig 2-4。

GroupDose/mg·kg-1iNOS/kU·L-1Ischemia30minI/R1hI/R3hCK-MB/U·L-1Ischemia30minI/R1hI/R3hSham-8.07±0.36**7.67±0.31**7.91±0.28**21.18±2.78**20.45±3.31**22.33±2.95**Model-13.14±0.30△16.09±0.47△19.22±0.91△166.04±19.91△190.24±18.58△225.87±22.37△BCFH209.74±1.02**#11.14±0.97**#13.73±0.77**#78.71±6.12**#95.78±8.95**#115.23±7.41**#BCFL1010.97±1.02*#12.54±0.69**14.84±0.93**#94.72±2.30**#110.92±9.55**#130.55±8.50**#3-MA1512.57±1.2713.38±0.68*16.32±0.52*152.31±7.46152.46±15.17*177.04±12.60*

*P<0.05,**P<0.01vsmodel;△P<0.05vssham;#P<0.05vs3-MA

Tab 2Effects of BCF on contents of T-AOC in

GroupDose/mg·kg-1T-AOC/kU·L-1Ischemia30minI/R1hI/R3hSham-14.28±0.39**13.23±0.80**13.95±0.61**Model-7.71±0.75△7.64±0.92△6.79±0.66△BCFH2011.16±1.36**#11.29±0.68**#9.12±0.61**#BCFL1010.30±1.04**#9.87±0.42*#8.74±0.87**3-MA158.72±0.538.89±0.79*8.51±0.92*

*P<0.05,**P<0.01vsmodel;△P<0.05vssham;#P<0.05vs3-MA

Fig 2Results of Western blot in rats with

myocardial ischemia 30 min

*P<0.05vsmodel;△P<0.05vssham;#P<0.05vs3-MA

4讨论

Fig 3Results of Western blot in rats with

myocardial ischemia/reperfusion 1 h

*P<0.05vsmodel;△P<0.05vssham;#P<0.05vs3-MA

Fig 4Results of Western blot in rats with

myocardial ischemia/reperfusion 3 h

*P<0.05vsmodel;△P<0.05vssham;#P<0.05vs3-MA

机体中总抗氧化能力的强弱，直接影响到心肌细胞的生存状态。心肌缺血/再灌注损伤(myocardial ischemia/ reperfusion injury，MIRI)发生时，大量钙离子内流、线粒体ATP生成减少、细胞内活性氧、NO增多[7]，细胞内活性氧可以促进自噬的发生，而抗氧化力增高则可抑制细胞过度自噬[9]。前期实验[10]表明BCF可以抑制CaR蛋白表达、减少钙离子内流，增强ATP酶活性，Tab 1-2亦显示BCF降低iNOS，增强总抗氧化力而减轻自噬。CK-MB是临床上常用的心肌损伤标志物[11]，其含量随着缺血/再灌注时间推移而升高。与模型组相比，自噬抑制剂3-MA对缺血期CK-MB含量无影响(P>0.05)，表明其抑制缺血期少量自噬发生对心肌的保护作用；在再灌注期，3-MA则通过抑制自噬的过度表达，进而减少心肌损伤标志物CK-MB的漏出(P<0.05)。与模型和3-MA组相比，BCF预处理均可剂量依赖性地减少心肌缺血期及再灌注期的CK-MB含量(P<0.05)，其对心肌损伤的保护作用是否与促进缺血期自噬发生或(和)抑制再灌注期自噬过表达有关？基于此思路，我们选择LC3-Ⅱ、Beclin-1、mTOR为切入点，进一步了解BCF对MIRI保护作用与影响自噬的关联。

LC3-Ⅱ是自噬的标志性蛋白，直接反映自噬发生程度[2]。自噬在心肌缺血时被诱发，再灌注期得到进一步加强。虽然缺血诱发的自噬对心肌有一定保护作用，但在再灌注阶段自噬的进一步加强则可能会诱导细胞死亡，过低或过高的自噬均会加重心肌损伤。心肌缺血/再灌注时LC3-Ⅱ水平上升，自噬发生。与模型组相比，BCF在缺血及再灌注期均下调LC3-Ⅱ蛋白表达，但相对于自噬抑制剂3-MA而言，BCF在缺血期上调LC3-Ⅱ表达，说明其可诱发缺血期自噬产生；在再灌注期，BCF下调LC3-Ⅱ表达，说明其抑制了自噬的过度表达而产生抗MIRI作用。

Beclin-1是调节细胞自噬过程的关键基因，Beclin-1介导的自噬/凋亡互反馈信号通路是经典的自噬信号途径之一[12]，而Beclin-1 / Bcl-2 的平衡状态则是调控自噬/凋亡互反馈作用的关键因素：Bcl-2可负性调节Beclin-1的致自噬作用，Bcl-2表达下调不仅可诱发凋亡还能通过激动Beclin-1来激活自噬，导致细胞死亡[2]。我们的前期实验表明，BCF通过上调Bcl-2蛋白表达而抑制细胞凋亡[6]，本研究结果显示：与模型组相比，BCF在缺血及再灌注期均下调Beclin-1蛋白表达(P<0.05)，但相对于自噬抑制剂3-MA而言，BCF上调缺血期Beclin-1表达(P<0.05)，可能通过Beclin-1介导的自噬/凋亡互反馈信号通路诱导缺血期自噬的产生；在再灌注期，Beclin-1蛋白表达随着时间的延长而增高，BCF通过下调Beclin-1蛋白表达，抑制细胞自噬的过度发生而减轻心肌损伤。因此，BCF对心肌损伤的保护作用可能与其调控缺血/再灌注不同时段Beclin-1蛋白的表达，进而影响Beclin-1介导的自噬/凋亡互反馈机制有关。

mTOR[13-14]是一种非典型的丝氨酸/苏氨酸激酶，属PIK3蛋白激酶类家族，在细胞生长、分化以及增殖等基本功能过程中起着中心调节的作用。mTOR与自噬的互反馈调控作用是促进细胞存活的重要机制。在自噬初期(缺血期)，mTOR通过对自噬的负调控作用诱导自噬产生，促进细胞存活。Fig 2显示在缺血期，与模型组相比，BCF上调mTOR表达(P<0.05)，但相对于自噬抑制剂3-MA而言，BCF下调mTOR的表达(P<0.05)；在再灌注期，BCF上调mTOR，并可能通过mTOR的负反馈调节作用抑制自噬，进而防止自噬过度发生，保护受损心肌。有意思的是，与3-MA相比，在MIRI的不同时段，BCF始终下调mTOR的蛋白表达，这提示在缺血期，BCF影响自噬，进而产生抗心肌损伤作用可能并非通过mTOR与自噬互反馈途径，而是通过Beclin-1介导的自噬/凋亡互反馈信号通路；在再灌注期，BCF则通过上调mTOR表达、下调Beclin-1表达，同时影响mTOR介导的自噬/mTOR互反馈信号通路和Beclin-1介导的自噬/凋亡互反馈信号通路，抑制自噬的过度表达，抗MIRI损伤。

综上所述，BCF可能通过缺血期诱导自噬发生，而再灌注期抑制自噬过表达，从而发挥抗心肌缺血/再灌注损伤作用，其详细机制还有待进一步研究。

参考文献:

[1]Ito B R,Gottlieb R A,Mentzer R M Jr. Autophagy and the human heart [J].JThoracCardiovascSurg，2014，148(1)：369-70.

[2]Wei K, Wang P, Miao C Y. A double-edged sword with therapeutic potential: an updated role of autophagy in ischemic cerebral injury [J].CNSNeurosciTher，2012，18(2)：879-86.

[3]马芹芹，刘立亚，黄秀兰. Beclin 1 与mTOR 对心肌缺血/再灌注损伤中自噬的交互调控机制 [J]. 心脏杂志，2012，24(3)：395-401.

[3]Ma Q Q, Liu L Y, Huang X L. Interactive regulation of Beclin 1 and mTOR in autophagy in myocardial ischemia reperfusion injury [J].ChinHeartJ，2012，24(3)：395-401.

[4]Salminen A, Kaarniranta K, Kauppinen A. Beclin 1 interactome controls the crosstalk between apoptosis, autophagy and inflammasome activation: impact on the aging process [J].AgeingResRev，2013，12(2)：520-34.

[5]林炜鑫，高杰，简洁，等. 大孔树脂纯化九龙藤总黄酮的工艺研究 [J]. 时珍国医国药，2013，24(5)：46-8.

[5]Lin W X, Gao J, Jian J, et al. Technology research for purification of Bauhinia championii flavones by macroreticular resin [J].LishizhenMedMatMedRes，2013，24(5)：46-8.

[6]林炜鑫，黎奕练，简洁，等. 九龙藤总黄酮对缺氧/复氧心肌损伤的作用 [J]. 中国药学杂志，2014，49(1)：36-9.

[6]Lin W X, Li Y L, Jian J, et al. Effects ofBauhiniaChampioniiflavones on hypoxia-reoxygenation Injury in myocardial cells [J].ChinPharmJ，2014，49(1)：36-9.

[7]高杰，付丽香，李冬兰，简洁. 九龙藤黄酮对大鼠心肌缺血/再灌注损伤的保护作用 [J]. 中国医院药学杂志，2014，34(3)：175-8.

[7]Gao J, Fu L X, Li D L, Jian J. Protective effect of Jiulongteng flavonoids on myocardial ischemia/reperfusion injury in rats [J].ChinJHospitalPharm，2014，34(3)：175-8.

[8]李冬，史大卓，刘秀华. 线粒体功能障碍与心肌缺血再灌注损伤 [J]. 中华老年心血管病杂志，2014，16(3)：318-21.

[8]Li D, Shi D Z, Liu X H. Mitochondrial dysfunction and myocardial ischemia-reperfusion injury [J].ChinJGeriatrHeartBrainVesselDis，2014，16(3)：318-21.

[9]刘重斌，王瑞，董缪武，等. 大蒜素对慢性铁中毒大鼠氧化应激与肝细胞自噬的抑制作用 [J]. 中国药理学与毒理学杂志，2012，26(4)：515-20.

[9]Liu C B, Wang R, Dong M W, et al. Protective effect of allicin against oxidative stress and hepatocyte autophagy in iron-overloaded rats [J].ChinJPharmacolToxicol，2012，26(4)：515-20.

[10]方瑜，孙瑶，简洁. 九龙藤总黄酮对垂体后叶素致大鼠急性心肌缺血的保护作用 [J]. 中国药理学通报，2013，29(11)：1592-6.

[10]Fang Y, Sun Y, Jian J. Protective effects of Bauhinia championii flavones on pituitrin-induced acute myocardial in rats [J].ChinPharmacolBull，2013，29(11)：1592-6.

[11]Dawie J, Chawla R, Worku Y, Azazh A. Diagnosis of ischemic heart disease using CK-MB, troponin-Ⅰand ischemia modified albumin [J].EthiopMedJ，2013，49(1)：25-33.

[12]Kang R, Zeh H J, Lotze M T, Tang D. The Beclin 1 network regulates autophagy and apoptosis [J].CellDeathDiffer，2011，18(4)：571-80.

[13]Sciarretta S, Volpe M, Sadoshima J. Mammalian target of rapamycin signaling in cardiac physiology and disease [J].CircRes，2014，114(3)：549-64.

[14]Yu L, McPhee C K, Zheng L, et al. Termination of autophagy and reformation of lysosomes regulated by mTOR [J].Nature，2010，465(7300)：942-6.

网络出版时间：2015-1-9 13:37网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/doi/10.3969/j.issn.1001-1978.2015.02.017.html

Effects ofBauhiniachampioniiflavones on adjusting

autophagy against myocardial ischemia/reperfusion injury

SUN Yao, ZHANG Chan, JIAN Jie

(CollegeofPharmacy,GuilinMedicalUniversity,GuilinGuangxi541004,China)

Abstract:AimTo study the effects of Bauhinia championii flavones(BCF) on adjusting autophagy against myocardial ischemia reperfusion injury. Methods120 SD rats were randomly divided into control, model, 3-MA (15 mg·kg-1) and BCF (10, 20 mg·kg-1) groups (n=8). 30min. ischemia, ischemia/reperfusion 1h.or 3h, while myocardial ischemia reperfusion model was established by ligating left anterior descending coronary artery. The contents of creatine kinase-MB (CK-MB), inducible nitric oxide synthase (iNOS) and total antioxidative capacity (T-AOC) in serum were determined according to the ultraviolet spectrophotometer colorimetric method. The protein expression of LC3-Ⅱ, Beclin-1 and mTOR was observed by Western blot. ResultsCompared with model group, BCF dose-dependently improved T-AOC, decreased CK-MB and iNOS (P<0.05). Meanwhile, BCF down-regulated the protein expression of LC3-Ⅱand Beclin-1, and up-regulated mTOR protein expression (P<0.05). Compared with 3-MA group, BCF reduced the contents of CK-MB and iNOS, increased the level of T-AOC. It raised LC3-Ⅱand Beclin-1 protein expression at 30min. of ischemia, and then declined the protein expression of LC3-Ⅱand Beclin-1. BCF descended the protein expression of mTOR all over the time (P<0.05). ConclusionAutophagy occurs in ischemia then improves in ischemia/reperfusion period. BCF could promote the occurring of autophagy at 30min. of ischemia in the short term and inhibit the excessive expression of autophagy with the increase of time in reperfusion period. BCF pretreatment reduce myocardial ischemia/reperfusion injury may by promoting the occurrence of autophagy during ischemia period and inhibit them in reperfusion.

Key words:BCF; regulation; autophagy; different periods; ischemia reperfusion injury; myocardial protection

通讯作者简洁(1972-)，女，博士，教授，研究方向：天然药物成分分离及心血管药理学，，Tel:0773-2295141，E-mail: jianjielucky@aliyun.com

作者简介：孙瑶(1989-)，女，硕士生，研究方向：天然药物成分分离及心血管药理学，E-mail：350911315@qq.com；

基金项目：国家自然科学基金资助项目(No 81360041)；广西自然科学基金资助项目(No 2012GXNSFAA053148)

收稿日期:2014-09-22,修回日期:2014-10-27

文献标志码：A

文章编号：1001-1978(2015)02-0232-05

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2015.02.017