唐古特大黄多糖对RAW264.7巨噬细胞免疫调节作用的影响

李龙昱(1978～)，男，汉族，甘肃籍，主管药师

唐古特大黄多糖对RAW264.7巨噬细胞免疫调节作用的影响

李龙昱

(青海省人民医院药学部)

摘要目的研究唐古特大黄多糖对RAW264.7巨噬细胞免疫功能的调节作用。方法以小鼠腹腔巨噬细胞系RAW264.7为研究对象，分不同浓度的唐古特大黄多糖实验组、脂多糖阳性对照组、不加任何样品的空白对照组。通过MTT实验、吞噬中性红实验、一氧化氮释放量及细胞因子(IL-1β、IL-6、IFN-α、IFN-γ)的分泌水平，研究唐古特大黄多糖的免疫调节作用。结果实验表明唐古特大黄多糖在一定浓度范围可以促进吞噬细胞的增殖，并可增强其吞噬作用；唐古特大黄多糖可以有效提高巨噬细胞产生NO的量，且对巨噬细胞的细胞因子IL-1β、IL-6、IFN-α、IFN-γ的分泌量均有一定程度的提高。结论唐古特大黄多糖具有较好的提高巨噬细胞免疫功能的作用。

关键词唐古特大黄巨噬细胞免疫调节

中图分类号R967

文献标识码A

DOI：10.13452/j.cnki.jqmc.2015.03.010

AbstractObjectiveTo investigate the influence of rheum tanguticum polysaccharides on the immunomodulatory effectsofRAW264.7macrophage.Methods To take murineintraperitonealRAW264.7macrophage as the research objects and different concentrations of rheum tanguticum polysaccharides and LPS injected into mice as positive control，without any treating asthe blank control.The influence of rheum tanguticum polysaccharides on the immunomodulatory effectsofRAW264.7macrophage was detected by MTT，phagocytosis test，NO release and the secretion of cytokines such as IL-1β，IL-6，IFN-α and IFN-γ.Results Experiments showed that rheum tanguticum polysaccharides can accelerate the proliferation of phagocytic cells to have a good phagocytosis.Besides，it can improve the macrophage to generate NO，and had a good promotion in enhancing the secretion of cytokines such as IL-1β，IL-6，IFN-α and IFN-γ.Conclusion Rheum tanguticum polysaccharides can obviously enhance the function of macrophage.

KeywordsRheum tanguticumMacrophagesImmunomodulatory effect

收稿日期2015-04-12

THE INFLUENCE OF RHEUM TANGUTICUM

POLYSACCHARIDES ON THE IMMUNOMODULATORY

EFFECTS OF RAW264.7MACROPHAGE

Li Longyu

(The Pharmaceutical Department of the People's Hospital of Qinghai Province)

唐古特大黄(R.tanguticumMaxim.exBalf.)是大黄药材的重要基原，《中国药典》收录的3种大黄基原中以唐古特大黄质量最优[1]。唐古特大黄为青海省的道地药材，临床主要用于治疗肾衰竭、重症急性胰腺炎、萎缩性胃炎等[2]。中药多糖在免疫调节方面展示出较好的潜力，受到越来越多的关注[3，4]。有文献报道大黄多糖具有免疫调节的作用[5]。故本研究以小鼠腹腔巨噬细胞系RAW264.7为研究对象，检测唐古特大黄多糖对巨噬细胞的体外免疫调控作用，为唐古特大黄多糖的综合开发和利用提供一定的参考依据。

1材料与方法

1.1　材料

1.1.1材料与试剂

唐古特大黄(青海省药材公司)；小鼠单核巨噬RAW264.7细胞株(江苏省药物研究所)；PBS(博士微生物工程有限公司)；胰蛋白酶(Bio-sharp公司)；DMEM培养液(Gibco公司)；胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)；青霉素-链霉素双抗(Hyclone公司)；MTT(solarbio)；脂多糖(LPS，Solarbio公司)。其他试剂均为分析纯。NO试剂盒、ELISA检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)。

1.1.2仪器与设备

超净工作台(苏州净化设备有限公司)；电子分析天平(AY220，日本岛津，精度为万分之一)；全自动酶标仪(Molecular Devices Spectra max PLUS 384，BIO-RAD)；超低温冰箱(MDF-382ECM，日本SANYO)；微型漩涡混悬器(WH-90A，上海振荣科学仪器有限公司)；CO2恒温培养箱(日本SANYO公司)；恒温水浴箱(常州国华电器有限公司)；超声波清洗器(KQ-500B，嘉禾仪器有限公司)。细胞培养瓶(Corning公司)；微量加样器(Eppendorf)；96孔板(Corning公司)。

1.2　实验方法

1.2.1唐古特大黄多糖的制备

取唐古特大黄适量，加20倍体积的水煎煮1 h后纱布过滤，药渣再加入10倍量的水煎煮1 h，合并两次煎煮的药液。取适量的水煎液，缓慢加入95%乙醇使乙醇终浓度达到70%，放入4 ℃冰箱静置过夜后，离心(3000r/min)10 min后抽滤，沉淀依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤脱色，得唐古特大黄粗多糖备用。

1.2.2RAW264.7细胞增殖实验

取对数生长期的RAW264.7细胞吹打均匀后按105个/孔接种于96孔培养板，每孔加入细胞200 μL，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养12 h，显微镜下观察，待细胞贴壁后，弃去上清液，分别加入用不含血清的DMEM的培养液配成的终浓度为10、25、50、100、200 μg/mL唐古特大黄多糖溶液200 μL，空白对照组为不含血清的DMEM培养液，阳性对照组用10 μg/mL LPS，每组设6个复孔。在相同的培养条件下分别继续培养24 h，弃掉培养上清液，每孔加入浓度为0.5 mg/mL的MTT溶液(PBS配制)，每孔200 μL，放入孵箱中继续培养4 h后每孔加入DMSO 150 μL，摇床上震荡5 min ，设定波长为490 nm，测定吸光度值。细胞的增殖能力用增殖指数表示，计算公式如下：

细胞增殖指数=样品的吸光度值/空白对照的吸光度值

1.2.3RAW264.7细胞吞噬中性红实验

参照文献方法测定[6]。细胞对中性红吞噬能力用吞噬指数表示。计算公式如下：

吞噬指数=样品的OD值/空白对照的OD值

1.2.4细胞因子的测定

将培养好的细胞，分别加入不同浓度的唐古特大黄多糖溶液，设空白对照组和阳性对照组(10μg/mL的LPS)，每组3个复孔。收集各组的上清液，按ELISA 试剂盒说明书测定各细胞因子(NO、IL-1β、IL-6、IFN-α、IFN-γ)的含量。

1.2.5数据分析

实验数据采用单因素方差(One-way ANOVA)分析，P值小于0.05表明组间有显著性差异。

2结果

2.1　唐古特大黄多糖对RAW264.7细胞增殖的影响

如图1所示，浓度为(10～200)μg/mL的唐古特大黄多糖对RAW264.7细胞的增殖指数相对于空白对照组有显著性差异(P<0.05)，其对巨噬细胞增殖指数随着样品浓度的增加而增大，表现出一定的量效关系。表明唐古特大黄多糖在一定浓度范围具有较好的促进RAW264.7细胞的增殖的作用。

2.2　唐古特大黄多糖对RAW264.7细胞吞噬作用的影响

腹腔巨噬细胞具有一定的吞噬能力，可以有效地吞噬外来的微生物或病毒，有效地保证机体免受外来病菌的入侵，发挥免疫调节作用，从而维持人体的健康。如图2所示，与空白对照相比，阳性药组能极显著(P< 0.001)地提高巨噬细胞吞噬中性红细胞的能力，吞噬指数的值为1.69；当浓度为10、25、50、100、200 μg/mL的唐古特大黄多糖溶液作用24 h后，巨噬细胞的吞噬指数与空白对照相比，均具有极显著性差异(P<0.05)。在(10～200)μg/mL浓度范围内，吞噬指数随浓度升高显著提高，表明唐古特大黄多糖具有提高巨噬细胞的吞噬作用的功能，可以有效地提高机体的免疫调节能力而达到抵御病菌的目的。

Figure 1　Effects of Rheum tanguticumpolysaccharide on the index of RAW264.7 cells proliferation(24h)

Figure 2　Effects of Rheum tanguticumpolysaccharide on RAW264.7 cells phagocytosis

2.3　唐古特大黄多糖对RAW264.7细胞释放NO的影响

NO是新发现的一种重要的信使分子，具有调节免疫功能的作用[7]。如图3所示，不同浓度的唐古特大黄多糖对RAW264.7细胞释放NO产生影响。当巨噬细胞未进行药物处理时NO释放量比较低，这可能与iNOS蛋白的表达有一定的关系。经过LPS刺激后，NO的含量显著增加(P<0.001)，含量达到65.27 μmol/L。与空白对照相比，当唐古特大黄多糖浓度为10 μg/mL时，无显著性提高。而当药物浓度为(25～200)μg/mL时可以明显提高NO的释放量。

Figure 3　Effects of Rheum tanguticumpolysaccharide on NO production of RAW264.7 cells

2.4　唐古特大黄多糖对RAW264.7细胞分泌细胞因子的影响

白介素-1(IL-1)又称淋巴细胞刺激因子，分为IL-1α和IL-1β两种，其中IL-1β是内皮细胞活化因子，是一种主要起免疫调节作用的激素样肽类物质。如图4所示，不同浓度的唐古特大黄多糖对巨噬细胞分泌IL-1β均有一定的提高。与空白组相比，当多糖浓度为(10～25)μg/mL时，IL-1β的含量无显著提高，而在浓度范围为(50～200)μg/mL时，具有显著性差异(P<0.05)。

Figure 4　Effects of Rheum tanguticumpolysaccharide on the IL-1β secretion of RAW264.7 cells

IL-6可由多种细胞如巨噬细胞、成纤维细胞、T细胞、B细胞等细胞产生。它可调节多种细胞的生长与分化，诱导B细胞的增殖分化，促进其分泌抗体，具有调节免疫应答、急性期反应及造血功能，并在机体的抗感染免疫反应中起重要作用。如图5所示，当唐古特大黄多糖浓度较低(10μg/mL)时，IL-6分泌量没有显著性的增加。当唐古特大黄多糖浓度为(25～200)μg/mL时有显著提高巨噬细胞分泌IL-6分泌的能力，200μg/mL的多糖组的IL-6分泌量达到141.12 pg/mL。

Figure 5　Effects of Rheum tanguticumpolysaccharide on the IL-6 secretion of RAW264.7 cells

Figure 6　Effects of Rheum tanguticumpolysaccharide on the IFN-αsecretion of RAW264.7 cells

Ⅰ型干扰素主要包括IFN-α、IFN-β，IFN-α主要由单核-巨噬细胞产生。如图6所示，当唐古特大黄多糖浓度为200 μg/mL时，巨噬细胞RAW264.7产生的IFN-α的量达到94.65 pg/mL，在浓度(25～200)μg/mL之间IFN-α产生的量呈现显著性差异。表明唐古特大黄多糖具有较好的刺激巨噬细胞分泌IFN-α作用。

N-γ也可使巨噬细胞表面MHCⅡ类分子的表达量增加，增强其抗原递呈的能力。此外还可以通过增强巨噬细胞表面表达Fc受体，促进巨噬细胞吞噬免疫复合物、抗体包被的病原体和肿瘤细胞。如图7所示，经LPS刺激后RAW264.7细胞分泌IFN-γ的含量相对于正常组显著增加(P<0.001)。唐古特大黄多糖各浓度组均有促进IFN-γ分泌的功能，在浓度范围为(25～200)μg/mL时有显著性差异(P<0.05)。表明唐古特大黄多糖具有较好的促进巨噬细胞分泌IFN-γ的功能。

Figure 7　Effects of Rheum tanguticumpolysaccharide on the IFN-γsecretion of RAW264.7 cells

3讨论

研究表明巨噬细胞是免疫系统中一种重要的吞噬细胞[6]。唐古特大黄多糖在一定的浓度范围内可以促进巨噬细胞的增殖。从巨噬细胞吞噬中性红细胞的实验可以看出，唐古特大黄多糖具有较好的吞噬作用，在(10～200)μg/mL浓度范围内，吞噬指数由1.16增加到1.78，表现出较好的量效关系。巨噬细胞发挥抗病毒、免疫调节、抗肿瘤等药效可以由NO的释放多少进行调节。通过唐古特大黄多糖作用于RAW264.7细胞，结果表明唐古特大黄多糖可以有效提高巨噬细胞产生NO的量，这可能与其能诱导RAW264.7 细胞中iNOS的表达有关。实验发现唐古特大黄多糖对NO产生明显的增加作用，而没有直接的细胞毒性作用，为随后有关对细胞因子产生的影响作用的研究提供一定的剂量参考。唐古特大黄多糖对巨噬细胞的细胞因子IL-1β、IL-6、IFN-α、IFN-γ分泌量的提高均有一定程度的影响，表明唐古特大黄多糖具有较好的提高巨噬细胞免疫功能的作用。现代研究表明，中药中的多糖在免疫系统调节方面起到重要的作用。但作为大分子化合物，其生物利用度比较低，多糖是如何发挥免疫调节作用的机制尚不明确，值得深入研究。本研究以传统中药大黄为研究对象，细胞实验已经初步证实大黄多糖具有较好的免疫调节的作用，为后续的整体动物免疫调节的研究提供了一定的参考依据。

参考文献

[1]李莉，刘凯，魏胜利，等.我国唐古特大黄主产区资源现状调查及其可持续利用途径分析[J].中国中药杂志，2014(08)：1407-1412.

[2]戴洁. 大黄药理研究与临床应用[J].天津药学，2011(04)：67-70.

[3]何燕，吴雄志，曾升平.中药多糖的免疫调节作用[J].四川中医，2001(02)：15-17.

[4]王统一，赵兵，王玉春.多糖免疫调节和抗肿瘤研究进展[J].过程工程学报，2006(04)：674-682.

[5]谢燕，李国文，马越鸣.大黄多糖研究进展[J].中国新药杂志，2010(09)：755-758.

[6]苏娣，张芸，戴竹青，等.毛蕊花糖对巨噬细胞RAW264.7的免疫调节作用[J].食品科学，2013(07)：250-253.

[7]程安玮.甘草多糖的提取及对小鼠腹腔巨噬细胞的免疫调节[D].江南大学，2008.