Ack-1和CDC42在胃癌组织中的表达和意义

※：青海省科技项目应用基础研究计划(2012-Z-727)

郜茜(1975~)，女，汉族，青海籍，副主任医师

Ack-1和CDC42在胃癌组织中的表达和意义

郜茜，卢永福，王昀，杨永成，蒋汉梅

(青海大学附属医院消化内科)

摘要目的探讨胃癌组织和癌旁组织中Ack-1、CDC42基因和蛋白的表达水平，了解两者在胃癌组织中的表达特点和相关性及对胃癌临床病理特点的影响。方法于胃癌病变处取2～4块黏膜活检，并在离癌旁大于5 cm处取正常组织1～2块。采用实时定量PCR(real-time PCR)和免疫印记(Western-blot)法检测胃癌组织和癌旁组织中Ack-1、CDC42基因和蛋白的表达量，并行相关分析。结果胃癌组织中Ack-1、CDC42 mRNA表达较癌旁组织明显增多，差异有统计学意义(P<0.01)，CDC42的表达与肿瘤浸润深度有关(P<0.01)；Ack-1、CDC42的表达呈明显正相关(r=0.481，P<0.01)。胃癌组织中Ack-1、CDC42蛋白量的表达也较癌旁组织明显升高，分别为(2.44±0.45)vs(1.34±0.24)(t=4.349，P<0.05)和(2.81±0.45)vs(1.37±0.31)(t=4.755，P<0.05)。结论Ack-1、CDC42在胃癌组织中的表达明显升高，其中CDC42和肿瘤的浸润深度有关。Ack-1和CDC42的表达呈明显正相关，提示二者在胃癌发生发展中起重要作用，有可能成为胃癌预后的判断指标和治疗靶点。

关键词Ack-1CDC42荧光定量PCR免疫印迹胃癌

中图分类号R735．2

文献标识码A

DOI：10.13452/j.cnki.jqmc.2015.03.008

AbstractObjectiveTo study the Ack-1and CDC42 expression in gastric cancer and its difference in the clinical and pathological features.Methods 42 cases of gastric cancer tissue confirmed by pathology and its adjacent normal tissue were collected.The expression of Ack-1 and CDC42 were evaluated by Real-time PCR and Western-blot.Results Both expression of Ack-1 and CDC42 in gastric cancer tissue were significantly increased compared with those in the adjacent normal tissue at the protein and mRNA level.The increased CDC42 was associated with local invasion in gastric carcinoma(P<0.01).And there was a positive correlation between the expression of CDC42 and Ack-1(r=0.481，P<0.01).Conclusion CDC42 and Ack-1 are obviously over expressed in gastric carcinoma tissue compared with those in the adjacent normal tissue at the protein and mRNA level，and there show a positive correlation between them.It is considered that they may play an important roles in the development and progression of gastric cancer，and may be a potential biomarkers for the prognosis and treatment of gastric cancer in the future.

KeywordsCDC42 Ack-1Real-timePCR Western-blotGastric cancer

收稿日期2015-02-04

EXPRESS AND SIGNIFICANCE OF CDC42 AND

Ack-1 IN GASTRIC CANCER

Gao Qian，Lu Yongfu，Wang Yun，Yang Yongcheng，Jiang Hanmei

(Department of Gastroenterology，The Affiliated Hospital of Qinghai University，Xining，Qinghai 810001，China )

胃癌发病机制尚有许多未明之处。近年来Rho家族蛋白在肿瘤方面的作用受到人们重视，其中CDC42是一个具有代表性的小分子G蛋白，它在细胞骨架调节、细胞运动、细胞凋亡、细胞恶性转化及肿瘤的浸润和转移等方面有重要作用[1-2]。Ack-1是CDC42下游的效应原件，主要分布于胞浆的非受体酪氨酸激酶，具有催化底物蛋白酪氨酸残基磷酸化激活底物酶活性的功能。近年来，国内外研究显示，Ack-1的表达、激活与肿瘤的发生侵袭转移等过程相关，但其在胃癌中的作用目前研究较少，且结论不一，Ack-1和CDC42在胃癌中的关系不明。本研究旨在通过实时定量PCR(real-time PCR)和蛋白免疫印迹(Western-blot)法检测Ack-1和CDC42在胃癌组织中的表达，探讨二者在胃癌组织中的表达特点及和胃癌临床病理特点的关系。

1材料与方法

1.1　材料

1.1.1标本

选取青海大学附属医院2010～2011年经胃镜检查并经病理确诊的胃癌患者42例，其中男性28例，女性14例，平均年龄(57.14±9.26)岁。入选患者无长期服用非甾体类抗炎药历史，检查前均未接受化疗、放疗和生物治疗。征得患者同意后，所有研究对象均接受胃镜检查及胃黏膜活检术，在胃癌病变处取2～4块黏膜，并在离癌旁>5 cm处取正常组织1～2块作为癌旁组织。

1.1.2试剂

Ack-1、CDC42多克隆兔抗人抗体均购自Sigma公司；mRNA提取试剂Trizol购自Ambion公司；RT2 cDNA sysnthesis kit、RT2 SYBR qPCR mix和引物的合成均由Qiagen提供。RIPA蛋白裂解液购自碧云天生物公司；BCA 蛋白定量试剂盒购自PRIECE公司；PVDF膜0.45μm购自Millipore公司。

1.2　实验方法

1.2.1实时定量PCR

实时定量PCR：按说明书用Trizole提取组织总RNA(每50～100mg组织加Trizole试剂1mL)，取2 μL用DEPC水稀释后测OD值，A260/A280在1.8～2.0之间，符合PCR反应要求。按cDNA反转录试剂盒说明书操作，配制20 μL反应体系合成cDNA。反应条件设置为37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，反应结束后置-20 ℃保存。逆转录所得cDNA进行荧光定量PCR检测。CDC42、Ack-1和18s的引物均为美国Qiagen公司预制定量PCR专用引物，引物序号分别为QT00066528、QT01014181和QT00199367。将目的基因及管家基因在不同的反应管中进行扩增， 反应体系均为20 μL， 反应条件：于95 ℃ 行2 min预变性后，94 ℃ 30 s，60 ℃ 1 min，40个循环。ABI 5700型实时荧光定量PCR仪监测记录数据， 结果根据标准曲线由软件自动计算后得出。每组标本重复3次，取平均值为Ct值。用2-△△Ct法进行目的基因表达的相对定量。△Ct值=目的基因Ct值﹣内参基因Ct值，△△Ct=△Ct癌组织﹣△Ct癌旁组织。以癌旁组织目的基因表达量为1，2-△△Ct值即为胃癌组织中目的基因较癌旁组织中目的基因的表达倍数。

1.2.2免疫印迹

免疫印迹： RIPA蛋白裂解液裂解组织(每20mg组织加入100～200μL裂解液)提取蛋白，按BCA蛋白定量试剂盒说明书操作进行蛋白定量。10%分离胶进行SDS-PAGE电泳(150V，1.5h)，100 V电压条件下转膜90 min，用含脱脂奶粉的TBST溶液室温下封闭1 h，一抗4 ℃下孵育过夜。用TBST溶液充分洗膜3次，10 min/次，然后加入相应二抗，室温下孵育1 h，TBST溶液洗膜3次，化学发光法显影。Quantity One软件进行目的蛋白及内参灰度值分析，以目的蛋白灰度值/内参蛋白灰度值为所测目的蛋白的相对含量。

1.3　统计学方法

2结果

2.1　Ack-1、CDC42 mRNA在胃癌组织和癌旁组织中的表达

Ack-1、CDC42mRNA在胃癌组织中的表达均明显高于癌旁组织的表达，差异有统计学意义(表1)，行相关性分析显示Ack-1、CDC42 mRNA的表达具有明显正相关性(图1，r=0.481，P<0.01)

Table 1　The relative expression of Ack-1 and CDC42 mRNA in the gastric carcinoma and

surrounding normal tissues( ± s)

Table 1　The relative expression of Ack-1 and CDC42 mRNA in the gastric carcinoma and

例数胃癌旁组织胃癌组织tPAck-14211.32±0.67-3.081<0.01CDC424211.37±0.70-3.416<0.01

Figure 1　The correlation between Ack-1 and CDC42 mRNA

2.2　Ack-1、CDC42蛋白在胃癌组织和癌旁组织中的表达

免疫印迹结果显示，胃癌组织中Ack-1、CDC42蛋白量的表达较癌旁组织中明显升高，分别为(2.44±0.45)vs(1.34±0.24)(t=4.349，P<0.05)和(2.81±0.45)vs (1.37±0.31)(t=4.755，P<0.05)(图2)。

Figure 2　Expression of CDC42 and Ack-1 in the gastric carcinoma and surrounding normal tissues

2.3　Ack-1、CDC42的表达和胃癌临床病理特点的关系

CDC42的表达与肿瘤浸润深度有关(P<0.01)。而Ack-1、CDC42的表达均与年龄、性别、有无淋巴结转移、肿瘤TNM分期和肿瘤的分化程度无关(P>0.05)(表2)。

Table 2　Relationship between CDC42 and Ack-1 mRNA expression and the clinicopathological

staging in gastric cancer( ± s)

Table 2　Relationship between CDC42 and Ack-1 mRNA expression and the clinicopathological

临床病理因素例数(n)CDC422-△△Ct值tPAck-12-△△Ct值tP年龄(岁) <50121.49±0.900.669>0.051.41±0.610.552>0.05 ≥50301.32±0.621.28±0.69性别 男281.33±0.77-0.502>0.051.32±0.76-0.034>0.05 女141.45±0.561.32+0.46

续表：

临床病理因素例数(n)CDC422-△△Ct值tPAck-12-△△Ct值tP浸润深度 T1+T2291.15±0.55-3.361<0.011.26±0.63-0.896>0.05 T3+T4131.86±0.791.46±0.74淋巴结转移 有281.37±0.76-0.039>0.051.33±0.680.109>0.05 无141.38±0.601.30±0.66TNM分期 Ⅰ+Ⅱ271.25±0.57-1.547>0.051.20±0.70-1.569>0.05 Ⅲ+Ⅳ151.59±0.881.53±0.57分化程度 低201.30±0.530.264※>0.051.20±0.590.613※>0.05 中161.41±0.831.41±0.84 高61.52±0.921.46±0.29

注：※为F值.

3讨论

肿瘤的侵袭和转移与细胞的迁移密切关系。其中Rho蛋白家族通过对细胞周期的进展、细胞的生存、生长、增殖和基因转录的调节对肿瘤的生长起着重要作用[1]。CDC42是一种鸟嘌呤三核苷酸(GTP)酶，是Rho家族蛋白(RhoGTPase)中的一种，全称为细胞分裂周期蛋白42(celldivisioncycle42)，在细胞骨架调节、细胞运动、细胞凋亡、细胞恶性转化及肿瘤的浸润、转移等方面发挥重要作用。CDC42表达增加可促进细胞分裂，加速细胞的生长和增殖，并能对抗和阻断促进癌细胞凋亡的信号转导途径，最终促进肿瘤的发生和发展[3-5]。有研究探讨了RhoA家族中5个重要蛋白RhoA、RhoB、RhoC、Rac1和CDC42在胃癌细胞系中的表达，与正常对照肠上皮细胞系相比，发现5种胃癌细胞系中CDC42 mRNA的表达均明显上调[6]，提示CDC42在胃癌的发生发展中起非常重要作用。本研究发现胃癌组织中CDC42 mRNA和蛋白的表达均显著升高，和癌旁组织相比具有统计学差异。同时发现CDC42 mRNA的表达量和肿瘤的浸润深度有关，处于T1、T2期浸润的胃癌组织中CDC42 mRNA表达量明显低于T3、T4期肿瘤，但和患者年龄、性别、有无淋巴结转移和肿瘤的分化程度等无关，提示了CDC42在胃癌对周围组织的侵袭性致病中有很重要的作用。

Ack-l蛋白属于酪氨酸激酶家族，最早是作为CDC42下游的作用蛋白被发现。作为CDC42下游的效应器，Ack-1参与了多条CDC42介导的信号通路，在细胞增殖、肿瘤侵袭中有重要作用。Ack-1与多种组织来源的肿瘤的发生发展有关。有研究表明，Ack-1通过抑制肿瘤抑制因子WWOX的活动，促进肿瘤发生和转移[6，7]。同时Ack-1基因在早期肿瘤和晚期肿瘤组织中存在差异表达，Ack-l在晚期肿瘤中的表达明显高于早期肿瘤[7]，提示Ack-l在恶性肿瘤的侵袭转移过程中起了很大作用。我们的研究结果显示无论基因水平还是蛋白水平，Ack-1在胃癌组织中的表达都显著高于癌旁组织。虽然我们的结果显示Ack-1在肿瘤的浸润深度、TNM分期等组间比较时无统计学差异，但在肿瘤浸润的T3-T4期、TNM分期的Ⅲ-Ⅳ期较肿瘤浸润的T1-T2期、TNM分期的Ⅰ-Ⅱ期，Ack-1基因表达仍有升高趋势，在高分化组织中也较低分化组织中升高，提示Ack-1可能参与了胃癌的浸润和分化过程。

Ack-l是CDC42的下游效应器，二者在对肿瘤的侵袭和转移可能起着一定的交互作用。在对黑色素瘤的研究中显示Ack-l、CDC42和黑色素瘤相关硫酸软骨素蛋白聚糖(MCSP)组成一个复合物，该复合物又进一步募集p130cas蛋白并使之发生酪氨酸磷酸化激活，从而促使黑色素瘤细胞发生运动迁移[8]。在我们的研究中发现胃癌组织中CDC42、Ack-1的mRNA表达水平呈明显正相关，提示在胃癌的发生发展过程中二者的表达可能存在着一定的正反馈机制，最终加速了胃癌的侵袭和转移，但这有待于进一步的深入研究。

我们的结果提示，Ack-1、CDC42在胃癌组织中的表达明显升高，其中CDC42表达与肿瘤浸润深度有关，而且CDC42、Ack-1表达呈明显正相关，提示CDC42、Ack-1在胃癌的发生发展中起重要作用，未来有可能会成为胃癌预后的判断指标和治疗靶点。

参考文献

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