血红素氧合酶-1在低氧条件下对大鼠肾缺血-再灌注损伤的保护机制 ※

※：青海大学中青年科研基金项目(项目编号：2011-QYY-6)

曹学锋(1977～)，男，汉族，甘肃籍，副教授

血红素氧合酶-1在低氧条件下对大鼠肾缺血-再灌注损伤的保护机制※

曹学锋，刘杰，王生兰，刘辉琦，文建军

(青海大学医学院，青海 西宁 810001)

摘要目的探讨血红素氧合酶-1(Heme oxygenase-1，HO-1)在低氧预适应时对大鼠肾缺血-再灌注损伤的保护机制。方法建立大鼠的肾缺血-再灌注损伤动物模型，观察大鼠再灌注后肾脏免疫组织化学变化；检测HO-1基因在大鼠肾脏的表达情况。并就上述结果行相关分析。结果与正常对照组相比，CoPP组HO-1mRNA表达量最高，其余依次降低为实验对照组、低氧+ZnPP组、低氧组，差异有显著性(P<0.01)。CoPP组SOD活性最高，其余依次为低氧组、ZnPP组，差异有显著性(P<0.05)。CoPP组MDA含量最低，其余依次升高为低氧组、低氧+ZnPP组、ZnPP组，差异有显著性(P<0.05)。结论经钴原卟啉(CoPP)处理和低氧预适应使HO-1表达增强，肾脏缺血-再灌注时的细胞损伤减轻，其机制可能与降低氧自由基损伤相关。

关键词血红素氧合酶-1肾缺血-再灌注损伤低氧预适应氧自由基

中图分类号R363

文献标识码A

DOI：10.13452/j.cnki.jqmc.2015.03.004

AbstractObjectiveTo investigate the protective effects of heme oxygenase-1(HO-1)in Renal ischemia/reperfusion injury on rats under hypoxia and explore the possible mechanism.Methods Rat renal ischemia/reperfusion injury model was established.The expression of HO-1 mRNA was detected by RT-PCR.The vitality of SOD and the quantity of MDA were detected in rat renal ischemia/reperfusion injury models treated with HO-1 inducer cobalt protoporphyrin(CoPP)，zinc protoporphyrin(ZnPP，HO-1 inhibitor)and hypoxic preconditioning.Results HO-1 mRNA level expression results showed that：compared with normal control group，the CoPP group expression was the highest，the other groups such as control group，hypoxia+ZnPP group，hypoxia group，also showed significant difference(P<0.01).SOD activity in CoPP group was the highest，followed with low oxygen and ZnPP group，respectively，showed significant difference(P<0.05).MDA content in CoPP group was the lowest，while the hypoxia，hypoxia+ZnPP group and ZnPP group showed significant difference(P<0.05) as well.Conclusion The up regulation of HO-1 expression induced by CoPP and hypoxic preconditioning can reduce the degree of damage of the tubular epithelial cells and subsequently alleviate the renal ischemia reperfusion injury.One of its main mechanisms may be related with anti oxygen free radicals.

Keywordsheme oxygenase-1renal ischemic /reperfusion injuryhypoxic preconditioningoxygen free radical

收稿日期2015-04-02

THE PROTECTIVE EFFECT OF HEME OXYGENASE-1 IN

RENAL ISCHEMIA/REPERFUSION INJURY ON

RATS UNDER HYPOXIA

Cao Xuefeng，Liu Jie，Wang Shenglan，Liu Huiqi，Wen Jianjun

(Qinghai University Medical College，Xining QingHai，810001)

近年来肾缺血-再灌注损伤(renal ischemia repergusion injury，RIRI)保护机制成为器官移植研究热点。血红素氧合酶-1(HO-1)是降解血红素的限速酶和关键酶，HO-1的保护效应是通过其降解产物实现的[1-2]。本实验采用HO-1抑制剂和诱导剂处理实验动物，观察HO-1在肾脏缺血-再灌注损伤模型中的表达，进而探讨HO-1 在肾脏缺血-再灌注损伤中的作用和机制。

1对象与方法

1.1　实验对象和分组

健康SD雄性大鼠60只随机分为6组，每组10只，体重(200±30)g，由甘肃省中医院动物实验中心提供。分组：(1)正常对照组：术前24 h 腹腔注射生理盐水；(2)实验对照组：术前切除右肾，夹闭左肾动脉缺血1 h，而后再灌注3 h；(3)CoPP组，于实验前24 h腹腔注射CoPP(5mg/ kg)，余同(2)组处理；(4)ZnPP组，于实验前24 h 腹腔注射ZnPP(5mg/kg)，余同(2)组处理；(5)低氧组，实验前24 h，放入低压氧仓(海拔4000m)，余同(2)组处理；(6)低氧+ZnPP组，于实验前24 h腹腔注射ZnPP(5mg/kg)并放入低压氧仓(海拔4000 m)，余同(2)组处理。

1.2　主要试剂

钴原卟啉(CoPP) 、锌原卟啉(ZnPP)购于美国Sigma公司；SOD(超氧化物歧化酶)、MDA(丙二醛)试剂盒、蛋白浓度测定试剂盒均购于南京建成生物工程研究所；免疫组化试剂盒购于武汉BOSTER公司；RT-PCR实验cDNA第一链合成试剂盒等均购于北京TIANGEN公司。

1.3　实验方法

1.3.1标本采集及处理

各组大鼠于缺血-再灌注后处死，取出肾脏组织，4%多聚甲醛固定和-80 ℃冰箱冷冻。

1.3.2免疫组化实验

按照免疫组化试剂盒说明进行具体实验操作，免疫组化实验结果判断标准：胞浆染色呈棕黄色颗粒为HO-1阳性反应，不着色为阴性。

1.3.3RT-PCR实验

从冰箱取重量约0.1 g肾组织，使用Trizol总RNA提取试剂盒，RT-PCR试剂盒进行RT-PCR检测。HO-1 的上游引物：5′-AGCATGTCCCAGGATTTG-3′，下游引物：5′-GCTCAATGTTGAGCACA-3′，扩增目的片段为615 bp。扩增内参为β-actin，上游引物：5′-TGGATGATGATATCGCCGCCG-3′，下游引物：5′-CTAGATGGGCACAGAGTGTGGCA-3′，目的基因扩增片段为501 bp。反应程序设定：95 ℃预变性3 min，95 ℃变性40 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min ，共35个循环。实时RT-PCR实验相对定量HO-1基因表达情况，制作内参基因和HO-1基因标准曲线后计算斜率并得出扩增效率，实验数据采用2(-ΔΔCt)法计算出HO-1mRNA的相对定量。

1.3.4超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量测定

将所取肾组织制作10%肾组织匀浆溶液，离心后吸取上清液，使用SOD检测试剂盒(WST法)检测SOD活性，以硫代巴比妥酸(Thibabituric Acid，TBA)比色分析法测定MDA含量，分光光度计定量测定。其操作步骤和公式计算均严格按照试剂盒使用说明进行。

1.4　统计学处理

应用SPSS16.0统计软件包，实验数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1　免疫组化实验结果

镜下见各组肾组织均有HO-1的表达，HO-1主要表达于肾小管上皮细胞和系膜细胞，胞浆中含棕黄色颗粒为表达阳性细胞；与正常对照组相比，CoPP组表达显著增强，低氧组次之，而ZnPP组表达相对降低(图1)。

AB

CD

A：正常对照组B：CoPP组C：低氧组D：ZnPP组

图1免疫组织化学染色阳性结果图(×40)

Figure 1Positive results of immunohistochemical staining (×40)

A：Normal groupB：CoPP model groupC：ZnPP model groupD：hypoxic preconditioning group

2.2　HO-1mRNA表达结果

HO-1mRNA水平表达结果显示，与正常对照组相比，实验对照组、CoPP组、低氧组和低氧+ZnPP组表达量明显高于正常对照组，差异有显著性(P<0.01)；与CoPP组相比较，ZnPP组、低氧组、低氧+ZnPP组表达量明显较高(P<0.01，见表1)。

表1　各组大鼠肾组织HO-1 mRNA表达比较( ± s)

Table 1　Comparison of rats kidney HO-1 mRNA expression among six groups( ± s)

表1　各组大鼠肾组织HO-1 mRNA表达比较( ± s)

组别nHO-1mRNA正常对照组100.44±0.09实验对照组100.67±0.08aCoPP组101.19±0.12abZnPP组100.42±0.06bC低氧组100.55±0.05abc低氧+ZnPP组100.66±0.08aC

注：a表示与正常对照组比较P<0.01，b表示与实验对照组比较P<0.01，c表示与CoPP组比较P<0.01.

2.3　各组肾组织中SOD活性和MDA含量

SOD活性正常对照组与实验对照组、CoPP组、ZnPP组相比较明显升高(P<0.05)，CoPP组与ZnPP组、低氧组比较有显著性(P<0.05)，而与低氧+ZnPP组相比较没有显著性。MDA含量正常对照组与实验对照组、CoPP组、ZnPP组、低氧组、低氧+ZnPP组比较有显著性(P<0.05)，实验对照组与CoPP组、ZnPP组、低氧组、低氧+ZnPP组比较有显著性(P<0.05，表2)。

表2　各组肾组织SOD活性和MDA含量的变化( ± s)

Table 2　The changes of SOD activity and MDA contents in the renal tissue( ± s)

表2　各组肾组织SOD活性和MDA含量的变化( ± s)

组别nSOD(nu/mg-prot)MDA(nmol/mgprot)正常对照组1094.32±23.214.52±5.2实验对照组10126.56±32.4a29.42±7.3aCoPP组10176.33±36.1ab14.78±4.8bZnPP组10132.14±22.2ac38.81±5.6abc低氧组10143.22±26.1ac20.67±8.2abc低氧+ZnPP组10165.12±35.8ab26.88±6.7ac

注：a表示与正常对照组比较P<0.05，b表示与实验对照组比较P<0.05，c表示与CoPP组比较P<0.05.

3讨论

肾移植过程中供肾缺血后再灌注时易产生大量活性氧(Reactive oxygen species，ROS)，其导致膜脂质过氧化增强、线粒体肿胀、溶酶体膜破坏，活性氧间接调控调亡相关基因表达，诱导移植器官发生细胞调亡，最终导致移植器官功能降低甚至丧失[3]。

HO-1是HO家族成员之一，属于诱导型，其可被多种有害刺激包括血红素、高氧、 缺氧、一氧化氮等诱导产生高表达；HO-1降解血红素产生胆红素、一氧化碳和铁；这些产物具有抗炎、抗氧化、抗凋亡、抗增殖等效应。有研究发现，应用HO-1诱导剂可显著减轻肾小球肾炎病程中的炎症细胞浸润和蛋白尿、肾小球血栓形成及肾小管损害[4-5]。Chok[6]等在大鼠肾脏缺血45 min后再灌注l h和24 h后，结果表明HO-1降低了肾小管的坏死程度，并且发现其损伤程度与半胱氨酸蛋白酶-3、微粒体前列腺素E合酶、C0X-2的表达呈明显负相关；缺血-再灌注损伤减轻其可能机制是通过减弱炎症浸润而发挥保护作用。HO-1还能够通过上调细胞周期从而抑制蛋白p21来影响肾小管上皮细胞周期从而阻止细胞凋亡[7]，还可通过阻止细胞自我吞噬从而减轻肾小管损伤[8]。

据此，本实验采用夹闭双侧肾动脉的方法制备大鼠肾缺血-再灌注动物模型，观察HO-1在肾缺血-再灌注损伤中的作用。并测定各实验组肾组织SOD活性及MDA含量，从而对HO-1在肾缺血-再灌注中的作用和机制进行了探讨。肾脏缺血-再灌注后，氧自由基生成大量增加，而SOD对自由基不能有效清除，致大量氧自由基堆积，因此SOD活性高低可间接反映机体清除氧自由基的能力。自由基攻击膜脂质并发生氧化， 脂质过氧化产物丙二醛(MDA)升高，依此测定肾脏MDA含量， 可间接反映体内自由基膜脂质过氧化程度[9-10]。

本次实验研究结果显示，SOD活性CoPP组明显升高，CoPP组与 ZnPP组、低氧组比较有显著性(P<0.05)，而与低氧+ZnPP组比较没有显著性，相对应的SOD活性较高组其MDA含量明显降低，统计学结果也显示差异具有显著性。同时CoPP组免疫组化结果表明在肾组织HO-1表达也明显升高，说明SOD在减轻再灌注损伤方面有积极作用；而ZnPP组因再灌注前使用HO-1抑制剂，抑制了HO-1表达，其抗氧化机制减弱，肾组织MDA含量明显增高，表明缺血-再灌注后大量自由基攻击生物膜，引发膜脂质过氧化增强，产生大量氧化产物丙二醛；同时自由基增多，使SOD在清除自由基过程中消耗增加，SOD活力下降，进一步说明HO-1诱导剂和低氧预适应对肾缺血-再灌注损伤的保护效应可能是通过抗氧化机制实现的。

其次RT-PCR实验结果显示，CoPP组与低氧组相比较，HO-1mRNA表达明显升高(P<0.01)，表明低氧预适应对于促进HO-1表达没有CoPP强烈。ZnPP组与实验对照组比较，肾组织中MDA含量明显升高(P<0.01)，提示ZnPP抑制剂通过抑制HO-1表达使肾缺血-再灌注损伤时自由基对肾组织的损伤加重。

综上所述，一定时间的低氧预适应和使用HO-1诱导剂具有拮抗自由基介导的组织细胞氧化损伤作用。

参考文献

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