TNF-α基因多态性与藏族骨关节结核患者预后

李得春(1968~)，男，土族，青海籍，副主任医师

TNF-α基因多态性与藏族骨关节结核患者预后

李得春，陆川，张国秋

(青海大学附属医院骨关节外科)

摘要目的检测分析TNF-α基因多态性与藏族骨关节结核患者预后的关系，探讨TNF-α在判断藏族骨关节结核预后中的价值。方法采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测青海地区藏族骨关节结核患者血清TNF-α表达水平，应用等位基因特异引物PCR(AS-PCR)分析TNF-α-308、TNF-α-238 位点启动子等位基因多态性，对受检患者进行随访，分析TNF-α表达在判断藏族骨关节患者预后中的价值。结果TNF-α在藏族骨关节结核患者血清中的表达水平(278.0±39.1ng/L)明显高于正常对照组(120.0±41.7ng/L)，差异具有统计学意义(P<0.05)；病例组TNF-α-308位点基因型及等位基因频率与对照组存在显著差异(P<0.05)，而TNF-α-238位点基因型及等位基因频率在青海地区藏族骨关节结核患者和对照组之间无显著差异(P>0.05)；TNF-α在判断藏族骨关节结核患者的预后中具有价值(P<0.05)。结论青海地区藏族骨关节结核患者中 TNF-α过度表达，且TNF-α-308基因多态性与青海地区藏族骨关节结核的发病可能存在关系；TNF-α表达水平可用来评估患者的预后，可作为藏族骨关节结核患者预后的标记物。

关键词骨关节结核肿瘤坏死因子α基因多态性藏族预后

中图分类号R322.7

文献标识码A

DOI：10.13452/j.cnki.jqmc.2015.03.002

AbstractObjectiveTo investigate the expression of TNF-α in osteoarticular tuberculosis of Tibetans，to test the associations between TNF-α-gene polymorphisms and OATB susceptibility in Tibetans and to clarify the prognosis value of TNF-α in the Tibetan patients with osteoarticular tuberculosis.Methods To detect the expression level of TNF-α in serum osteoarticular tuberculosis of Tibetans by using ELISA.To develop an allele-specific polymerase chain reaction(AS-PCR)assay to identify the polymorphisms of TNF-α-238 and-308 locus，to clarify the prognosis value of TNF-α in the Tibetan patients with osteoarticular tuberculosis.Results The expression level of TNF-α in Tibetan patients with osteoarticular tuberculosis(278.0±39.1ng/L)was significantly higher than that in normal control group(127±52.2ng/L)，with significant difference(P<0.05).TNF-α-308 locus distributions and their frequencies between the patients and controls show statistical significant.TNF-α-238 locus distributions and their frequencies between the patients and controls had no statistical significant.TNF-α could evaluate prognosis of OATB.Conclusion TNF-α is overexpressed in Tibetan patients with osteoarticular tuberculosis，and TNF-α-308 gene polymorphisms may be associated with susceptibility of OATB，and TNF-α can be used as marker for predicting the prognosis of OATB.

KeywordsOsteoarticular tuberculosisTumor necrosis factor-alphaGenetic susceptibilities TibetanPrognosis

收稿日期2015-01-03

THE RELATIONSHIP BETWEEN THE TUMOR NECROSIS

FACTOR-α GENE POLYMORPHISMS AND PROGNOSIS TO

OSTEOARTICULAR TUBERCULOSIS (OATB) IN TIBETANS

Li Dechun，Lu Chuan，Zhang Guoqiu

(Department of Joint，Qinghai University Affiliated Hospital，Xining 810001，China)

青海地区藏族骨关节结核发病率较高，其原因不明[1]。肿瘤坏死因子(TNF)-α主要由活化的巨噬细胞产生，是机体防御外界刺激的重要细胞因子，对机体的免疫细胞及免疫系统都具有重要作用[2]。TNF-α的基因多态性受地理环境、民族的影响。TNF-α基因多态性与藏族人群骨关节结核关系的报道较少且结论不一。本研究通过对青海地区藏族人群TNF-α基因多态性在骨关节结核发生发展过程中的表达与作用分析，厘清相关关系。

1资料与方法

1.1　研究对象

选取2009年01月～2011年12月在青海大学附属医院关节外科住院治疗的确诊为骨关节结核的青海籍81例藏族患者为病例组，其中男44例；平均年龄(42.6±7.8)岁。选取同期本院青海籍55例藏族健康体检者作为对照组，其中男36例；平均年龄(38.3±10.2)岁。排除可能影响易感性的患者。将病例组及对照组受试者的性别、年龄等情况进行统计学分析，无统计学差异。

1.2　研究方法

1.2.1TNF-α水平测定

采集清晨空腹时两组受试者肘静脉血液标本，常温下30 min内离心(2000r/min)10 min，分离上层血清于-20 ℃冰箱保存待用。采用酶联免疫吸附法进行TNF-α水平测定，操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。试剂盒购买于上海生物工程技术有限公司。

1.2.2TNF-α 308、TNF-α 238基因多态性分析

将所取受试者空腹的外周静脉血5 mL，加入EDTA-K2抗凝管中，DNA提取严格按照试剂盒说明书进行，并于-20 ℃。试剂盒购买于美国Gibco公司。采用等位基因特异引物聚合酶链反应(AS-PCR)分析TNF-α 308、TNF-α 238基因多态性。根据NCBI获取TNF-α基因序列，引物由北京博奥森生物技术公司合成，TNF-α 308 G/A 引物序列为F：5′-AATAGGTTTTGAGGGGCAAGG-3′，R：5′-AGGGAGCGT CTGCT GGCT G-3′。TNF-α 238 G/A引物序列为F：5′-CCGTGCTTGGTGCTTTGGACTA-3′，R：5′-AGAGCTGGTGGGGACATGTCTG-3′。根据所购即用型聚合酶链反应(PCR)试剂盒构成反应体系，反应条件为： 94.0 ℃预变性3 min，94.0 ℃变性1 min，63.3 ℃退火1 min，72.0 ℃延伸1 min，共40个循环，最后于72 ℃延伸5 min完成扩增；采用琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，使用美国Bio-Rad Gel DOC 2000凝胶电泳成像分析系统确定启动子等位基因及基因型。TNF-α-308位点等位基因和基因型的鉴定：PCR产物中出现135 bp条带为GG基因型(野生型纯合子)、360 bp条带为AA基因型(野生型纯合子)，135 bp、360 bp条带同时出现为GA基因型(突变型杂合子)；TNF-α 238位点等位基因与基因型的鉴定：PCR产物中出现206 bp条带为GG基因型(野生型纯合子)、287 bp条带为AA基因型(野生型纯合子)，206 bp、287 bp条带同时出现为GA基因型(突变型杂合子)。

1.3　统计学处理

2结果

2.1　血清TNF-α水平

骨关节结核患者血清中TNF-α表达量明显高于正常对照组，差异具有统计学意义(P<0.01)，见表1。其平均表达量为(278.0±39.1)ng/L，其中表达量高于平均水平者为高表达，共42人；表达量低于平均水平者为低表达，共39人。

表1　骨关节结核患者与对照组血清中TNF-α表达水平的比较结果(ng/L， ± s)

Table 1　Serum TNF-α levels in bone & joints TB patients and control (ng/L， ± s)

表1　骨关节结核患者与对照组血清中TNF-α表达水平的比较结果(ng/L， ± s)

组别男性nTNF-α含量女性nTNF-α含量合计nTNF-α含量病例组44276.0±49.337280.0±50.081278.0±39.1对照组36119.0±55.919121.0±52.655120.0±41.7t13.3411.0722.51P<0.01<0.01<0.01

2.2　TNF-α-308、TNF-α-238位点启动子等位基因及基因型频率比较结果

病例组与对照组TNF-α- 308位点等位基因与基因型频率相比较具有显著统计学意义(P<0.05，见表2)。病例组与对照组TNF-α-238位点等位基因与基因型频率比较，差异无统计学意义(P>0.05，见表3)。

表2　TNF-α-308位点等位基因及基因型频率比较[ n(%)]

表3　TNF-α-238位点等位基因及基因型频率比较[ n(%)]

3讨论

关于不同地域、种族、民族之间TNF-α基因多态性与骨关节结核的关系的研究已有报道，多数研究结果显示TNF-α-308、TNF-α-238位点基因具有多态性，但结果不尽相同[3-4]。研究表明，TNF-α能结合破骨细胞前体细胞上的相应受体，不同程度地调节破骨细胞的分化、激活和凋亡[5]，增强破骨细胞的功能，促进其破坏骨质的能力。也有研究表明，TNF-α基因多态性影响TNF-α产物的表达，不同基因型的TNF-α可以产生不同的蛋白，从而导致疾病类型的不同以及疾病严重程度的不同，然而目前对TNF-α基因多态性于骨关节结核发病的研究报道较少，且大多报道只阐明了TNF-α在骨关节结核患者血清中的表达水平，其表达与患者预后的关系研究很少。尤其对青海地区藏族。青海地区藏族骨关节结核的发病率高，TNF-α基因多态性在青海地区藏族人群中骨关节结核发病、发展及预后中的作用有待进一步研究。

本研究对青海地区藏族人群中骨关节结核患者TNF-α-308、TNF-α-238等位基因及基因型进行鉴定。研究结果显示，TNF-α在骨关节结核患者血清中的表达水平明显高于对照组，提示其表达量与骨关节结核的发病相关；病例组和对照组TNF-α-308位点基因型的分布频率存在显著差异，青海地区藏族骨关节结核患TNF-α-308位点G/A、A/A基因型频率明显高于对照组；青海地区藏族骨关节结核患者TNF-α-308 A等位基因频率也明显高于对照组。表明青海地区藏族人群中骨关节结核患者TNF-α-308 A的表达水平明显高于正常人，提示TNF-α-308 A等位基因高表达的藏族人群可能更易于感染骨关节结核，其表达水平与骨关节结核的发病率呈正相关。此外，研究结果提示TNF-α-308位点基因多态性与藏族人群骨关节结核的发病可能存在一定的正相关性，这与林春燕等[6]的研究结果具有相似性；而TNF-α-238位点等位基因及基因型分布频率在病例组和对照组中无明显统计学差异，表明TNF-α-238位点基因多态性与青海地区藏族人群骨关节结核的发病无明显相关性。除此之外，本研究还对进行手术治疗的骨关节结核患者进行密切随访，结果发现TNF-α表达水平较低的骨关节结核患者术后出现疼痛或复发的时间明显晚于TNF-α高表达的骨关节结核患者，即TNF-α表达水平越低，患者的预后越好，反之亦然。TNF-α表达水平与患者的预后呈负相关，差异具有统计学意义，提示TNF-α的表达水平对判断骨关节结核患者的预后具有指导意义，可能是骨关节结核患者预后不良的标记物。检测TNF-α表达水平对指导临床用药量、用药时间具有一定的作用。

综上所述，青海地区藏族人群骨关节结核患者中TNF-α表达水平明显增高，并且TNF-α-308基因多态性与青海地区藏族人群骨关节结核的发病率呈正相关；TNF-α的表达对评估患者的预后、指导临床用药具有一定价值，这也是本研究较以往报道的不同之处。但本研究属于单中心的研究，且样本量较小，数据统计过程中难免出现偏倚，其TNF-α用于判断患者的预后的可信度需要多中心大样本的实验进一步验证。

参考文献

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[2]Englund M.The role of the meniscus in osteoarthritis genesis[J].Rheum D is Clin North Am，2008，34( 3 )：573- 579.

[3]Sharma S，Rathored J，Ghosh B，et al.Genetic polymorphisms in TNF genes and tuberculosis in North Indians[J].BMC Infect Dis，2010，10(1)：165.

[4]Pacheco AG，Cardoso CC，Moraes MO.IFNG+874T/A，IL10-1082G/A and TNF-308G/A polymorphisms in association with tuberculosis susceptibility a meta-analysis study[J].Hum Genet，2008，123(5)，477-484.

[5]Garg RK，Somvanshi DS.Spinal Tuberculosis：A Review[J].The journal of spinal cord medicine，2011，34(14)：440-454.

[6]林春燕，杨玉芳，方菊飞，等.骨关节结核与TNF-α基因多态性的关系[J].中国脊柱脊髓杂志，2011，21(5)：427-428.