影响冠突散囊菌孢子产生的因素

吕嘉枥， 郑欣欣， 李文娟， 张彪燕

(陕西科技大学 食品与生物工程学院, 陕西 西安　710021)



影响冠突散囊菌孢子产生的因素

吕嘉枥， 郑欣欣， 李文娟， 张彪燕

(陕西科技大学 食品与生物工程学院, 陕西 西安710021)

摘要：为获得各种条件下冠突散囊菌的产孢规律和最佳生长发育条件，以冠突散囊菌的菌落形态、菌落直径、有性孢子和无性孢子的数量为指标，通过改变CZG培养基中碳源(蔗糖、葡萄糖)、氮源(硝酸钠、硝酸铵、硫酸铵)和无机盐(氯化钠 、氯化钾)的浓度以及外界培养条件(培养温度、培养基pH)以此得到最佳的培养参数.结果表明：冠突散囊菌产孢的最佳条件为蔗糖5%、硝酸铵0.7%、KCl 3%、培养温度28 ℃、pH=7，营养物质和外界培养条件都会对冠突散囊菌的产孢过程造成影响，使冠突散囊菌向有性或无性方向生长.

关键词：冠突散囊菌； 无性孢子； 有性孢子

0引言

冠突散囊菌(Eurotiumcristatum)是茯砖茶“发花”过程中优势菌[1-3]，在茯砖茶表面有大量肉

眼可见的金黄色颗粒，即为冠突散囊菌产生的闭囊壳，俗称“金花”，它是形成茯砖茶独特品质和风味的主要因素，也是评价茯砖茶品质好坏的重要指标[4-9],冠突散囊菌的繁殖方式既有无性生殖(分生孢子)，又有有性生殖(子囊孢子).

刘作易[10]等对冠突散囊菌孢子的产生条件进行研究，表明冠突散囊菌在不同蔗糖浓度下繁殖方法不同，低浓度的蔗糖有利于有性孢子的产生，高浓度的蔗糖有利于无性孢子的产生.目前对冠突散囊菌孢子的研究主要是利用DNA克隆技术研究冠突散囊菌中有性发育相关的veA基因片段[11-14]，通过基因水平上的研究，最终确定影响冠突散囊菌孢子产生的遗传控制信息.谭玉梅[15]等以谢瓦氏曲霉间型变种的有性阶段、无性阶段及其营养菌丝体时期的样品为材料构建差减文库，筛选产孢时期特异表达的基因，从而为进一步研究基因之间的关系、基因与发育的关系、产孢调控机制，但冠突散囊菌孢子的产生不仅受内在的遗传信息的控制，而且受营养物质和外界环境因素的影响.

本研究以茯砖茶中的优势菌种为研究对象，通过综合研究营养条件(碳源、氮源、无机盐)和外界培养条件(温度、pH)对冠突散囊菌产孢的影响，最终确定最佳的培养条件.

1材料与方法

1.1菌种

冠突散囊菌(Eurotiumcristatum)：由陕西科技大学生命科学与工程学院微生物教研室提供(陕西科技大学微生物研究室从陕西苍山茶叶有限责任公司所产茯砖茶中分离纯化得到).

1.2材料

1.2.1培养基

CZG培养基：蔗糖4.0 g，NaCl 5.0 g，K2HPO40.1 g，NH4NO30.3 g，MgSO4·7H2O 0.05 g，琼脂2.0 g，水100 mL ，于121 ℃、1×105Pa灭菌锅中灭菌30 min.

1.2.2仪器与设备

B203LEDR生物显微镜(重庆奥特光学仪器有限公司)，101-1电热恒温培养箱型(北京科伟永兴仪器有限公司)，SW-型超净工作台(苏净集团安泰公司)，UV-2600可见紫外分光光度计(尤尼柯仪器有限公司).

1.3实验方法

1.3.1碳源对冠突散囊菌的影响

以蔗糖、葡萄糖分别为CZG培养基中的碳源，浓度分别为1%、3%、5%、7%、10%～90%，每个浓度梯度做三次平行实验.

1.3.2氮源对冠突散囊菌的影响

以硝酸钠、硝酸铵、硫酸铵分别为CZG培养基中的氮源，浓度分别为0.1%、0.3%、0.5%、1%～11%，每个浓度梯度做三次平行实验.

1.3.3无机盐对冠突散囊菌的影响

以氯化钠和氯化钾分别为CZG培养基中的无机盐，浓度分别为1%～15%，每个浓度梯度做三次平行实验.

1.3.4培养温度对冠突散囊菌的影响

以CZG为基础培养基，接种冠突散囊菌后分别在15 ℃～40 ℃温度下培养，每个温度梯度做三次平行实验.

1.3.5培养基pH对冠突散囊菌的影响

配制不同pH的CZG培养基，使冠突散囊菌分别在pH为3～10条件下生长，用1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH溶液调节培养基pH.每个pH梯度做三次平行实验.

1.3.6正交设计

通过单因素实验确定碳源、氮源、无机盐、培养温度和培养基pH，选择碳源、氮源、无机盐、培养温度进行正交试验，筛选各因素最佳水平，设计L9(34)正交表考察各因素.

表1　正交试验因素水平表

1.4测定方法

1.4.1冠突散囊菌菌落直径的测量

冠突散囊菌在28 ℃恒温培养箱中培养到5 d时，用十字交叉法在培养皿上对冠突散囊菌菌落直径进行测量，每处理三次重复.

1.4.2冠突散囊菌孢子数的测定

冠突散囊菌有性的子囊孢子和无性的分生孢子在显微镜下难以区分，采用血球计数板计算孢子数量准确性难以保证，因此采用棉兰染色法制片，在显微镜10倍镜下任意确定3个视野分别计数包裹子囊孢子的子囊果和代表无性孢子的顶囊数目，每处理三次重复.

2结果与讨论

2.1影响冠突散囊菌的单因素实验

2.1.1碳源对冠突散囊菌的影响

图1表明菌落直径的总体趋势是随浓度先增大后减小，在浓度为30%时菌落直径达最大值，在浓度为5%时存在一个小高峰.图2表明有性孢子个数的变化趋势同菌落直径，无性孢子在浓度为20%时开始一直增加.通过对比蔗糖和葡萄糖对菌落直径和孢子数的影响结果，确定实验的碳源选择蔗糖，在蔗糖浓度为5%和30%时，菌落直径和有性孢子的个数都比相邻的浓度大，但由于蔗糖浓度在30%处已经有无性孢子产生，所以蔗糖浓度选为5%.

图1　碳源对冠突散囊菌菌落直径的影响

图2　碳源对冠突散囊菌孢子数的影响

2.1.2氮源对冠突散囊菌的影响

图3表明硝酸铵和硫酸铵浓度在5%以上时冠突散囊菌不能生长，只有在硝酸钠的培养基上可以正常生长.菌落直径趋势总体是先增大后减小，在浓度为3%处达到最大值，在0.5%处有小转折，而图4中有性孢子个数也是先增大后减小，在氮源浓度为1.0%时硝酸铵有性孢子个数最高，且在0.5%时菌落直径和有性孢子达到最大，且未出现无性孢子，所以硝酸铵浓度选在0.5%.

图3　氮源对冠突散囊菌菌落直径的影响

图4　氮源对冠突散囊菌孢子数的影响

2.1.3无机盐对冠突散囊菌的影响

图5表明菌落直径随盐浓度先增大后减小，在盐浓度为3%时菌落直径达最大值，图6表明，有性孢子的个数随浓度先增大后减小，且在3%时有性孢子数量最多.而无性孢子则是从达到4%开始一直增加.由图可知氯化钾优于氯化钠，所以实验的盐离子选择氯化钾，另外，在氯化钾浓度为3%时，菌落直径和有性孢子的个数都是最大值，而且在此浓度时无性孢子的个数为0，因此确定出氯化钾的浓度为3%.

图5　盐离子对冠突散囊菌菌落直径的影响

图6　盐离子对冠突散囊菌孢子数的影响

2.1.4培养温度对冠突散囊菌的影响

图7表明冠突散囊菌菌落直径随温度先增大后减小，在28 ℃时菌落直径最大，冠突散囊菌在极低极高温度下生长能力都降低，图8表明冠突散囊菌有性孢子个数随温度先增大后减小，在28 ℃时有性孢子密集，培养温度达到30 ℃开始产生无性孢子，无性孢子随温度升高先增大后减小.表明冠突散囊菌在低温下易产生有性孢子，而在高温下易产生无性孢子.

图7　温度对冠突散囊菌菌落直径的影响

图8　温度对冠突散囊菌孢子数的影响

2.1.5培养基pH对冠突散囊菌的影响

图9表明冠突散囊菌菌落直径随培养基pH增大呈先增大后减小的趋势.冠突散囊菌可以在偏酸性条件下生长，当培养基pH达到10时冠突散囊菌不生长.图10表明有性孢子随pH增大呈现先增大后减小的趋势，无性孢子呈先减小后增大的趋势，有性孢子和无性孢子在pH为7时达到极值.并且冠突散囊菌在极酸极碱条件下都易产生无性孢子.

图9　pH对冠突散囊菌菌落直径的影响

图10　pH对冠突散囊菌孢子数的影响

2.2冠突散囊菌的正交试验

表2　正交试验设计及结果分析

根据极差R的大小，进行因素的主次排列.

当以有性孢子个数为指标时，由R值主次排列为：温度>蔗糖>硝酸铵>氯化钾，因此最佳的水平组合为A1B2C2D2.当以菌落直径为指标时，由R值主次排列为：温度>蔗糖>硝酸铵>氯化钾，确定最佳水平组合为A1B2C3D2.

当以无性孢子个数为指标时，由R值主次排列为蔗糖>氯化钾>硝酸铵>温度，确定最佳水平组合为A1B2C1D1.

综上所述，确定最佳温度为28 ℃，碳源选2水平时三个指标同时达到极值，当氮源选择2水平时有性孢子最多，但相应的无性孢子也增多，同时考虑氮源对菌落直径的影响，因此氮源浓度选择3水平，盐离子选择1水平时三个指标同时达到极值.因此，本试验的最佳水平组合为A1B2C3D2.

正交试验结果表明：冠突散囊菌的最佳产孢条件为：氯化钾1%、蔗糖5%、硝酸铵0.7%、培养温度为28 ℃、培养基pH为7.

3结论

冠突散囊菌对营养物质和外界培养条件都很敏感，冠突散囊菌随无机盐、碳源、氮源等浓度的增加,有性孢子个数和菌落直径都是先增大后减小，而无性孢子随浓度增加呈上升趋势.营养物质大于冠突散囊菌的自身需求时容易产生无性孢子.冠突散囊菌随培养温度升高有性孢子个数先增大后减小，无性孢子却呈增长趋势，在正常pH条件下能够产生大量有性孢子，而在极酸极碱条件下却易产生无性孢子.表明冠突散囊菌在外界培养条件为极温、极酸极碱等不适宜生长时容易产生无性孢子，从而达到抵抗外界极性条件的目的.

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Factors of affectingEurotiumcristatumspores

LV Jia-li， ZHENG Xin-xin， LI Wen-juan， ZHANG Biao-yan

(School of Food and Biological Engineering, Shaanxi University of Science & Technology, Xi′an 710021, China)

Abstract:In order to obtain the spores production rule and optimal growth condition during growth process of Eurotium cristatum,taking colony morphology,sexual spores and asexual spores of Eurotium cristatum as indicators in this study,nutrients (carbon,nitrogen,inorganic salts) and culture conditions (temperature,pH)have an effect on the Eurotium cristatum which produced spores.The results showed that the Eurotium cristatum produced spores with optimum conditions:5% of sucrose,0.7% of ammonium nitrate,3% of KCl,the culture temperature was 28 ℃ and the pH value was 7.It was important that nutrients and external culture conditions impacted on Eurotium cristatum produced spores and maked the Eurotium cristatum to grow in the direction of sexual or asexual.

Key words:Eurotium cristatum； asexual spore； sexual spore

中图分类号：Q93-335

文献标志码：A

文章编号：1000-5811(2015)02-0116-05

作者简介:吕嘉枥(1964-)，女，陕西三原人，教授，研究方向：食品与生物发酵

基金项目：陕西省教育厅专项科研计划项目(2010JK446)； 咸阳市科技计划项目(2013K06-09)

收稿日期:*2014-12-05