维药异常黑胆质成熟剂总黄酮杀伤K562/ADR细胞株作用研究

维药异常黑胆质成熟剂总黄酮杀伤K562/ADR细胞株作用研究

刘玉， 娄珊， 严媚， 王学梅

(新疆医科大学第一附属医院儿科， 乌鲁木齐830054)

摘要：目的探讨维药异常黑胆质成熟剂总黄酮(ASMq)对人慢性骨髓性白血病细胞(K562)及人白血病阿霉素耐药株(K562/ADR)的细胞毒性作用。方法对K562细胞株及K562/ADR细胞株细胞进行培养，在培养过程中注意K562/ADR细胞株对阿霉素的耐药性。取对数生长期K562、K562/ADR细胞株，96板孔中加入RPMI-1640培养液配制5×104个/mL细胞悬液100 μL/每孔，37℃、5% CO2培养24 h贴壁，然后加入不同浓度(0、50、100、200、400、800和1600 μg/mL)的ASMq，在37℃共培养48 h，每组5个重复，按照CCK-8说明书检测细胞活性。结果K562细胞株对不同浓度的ASMq的细胞毒性的敏感性不同，差异有统计学意义(P<0.05)；K562/ADR细胞株对0～1 600 μg/mL浓度的ASMq的细胞毒性的敏感性差异无统计学意义(P>0.05)；结论ASMq对K562细胞具有细胞毒性作用，为临床治疗血液肿瘤提供了新的线索。

关键词：异常黑胆质成熟剂总黄酮； K562； K562/ADR； 杀伤； 耐药逆转

中图分类号：R29文献标识码：A

doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2015.04.008

[收稿日期：2014-10-25]

Preliminary study on destruction K562/ADR cell effects of

Abnormal Savda Munziq total flavonoids

LIU Yu, LOU Shan, YAN Mei, WANG Xuemei

(DepartmentofPediatry,TheFirstAffiliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversity,

Urumqi830054,China)

Abstract:ObjectiveTo analyse cytotoxicity function of the abnormal savda munziq total flavonoids (ASMq) on K562 and K562/ADR of human being. MethodsK562 and K562/ADR cells were developed to pay attention to adriamycin resistance of K562/ADR. The logarithmic phase K562 and K562/ADR cells 96-well plates with RPMI-1640 culture make up 5×104/mL cells suspension 100 μL/per hole, 37℃ and 5% CO2 24 h post wall were pouring into different concentrations (0, 50, 100, 200, 400,800 and 1 600 μg/mL) of 37℃ ASMq trained 48 h to detect cell activity by the instruction (CCK-8). ResultThere is a statistically significant difference (P<0.05) of K562 with different concentration of ASMq cytotoxic sensitivity. The cytotoxicity of different concentration ASMq to K562/ADR has no statistical significance (P>0.05). ConclusionASMq has cytotoxic effect on the K562 cells, Blood tumor chemotherapy to reduce drug resistance for clinical treatment provides a new clue.

Key words： ASMq； K562； K562/ADR； Cytotoxic

近10多年来肿瘤的临床化学药物治疗进展较快，尤其是按照细胞动力学的特点设计铺排的联合序贯化疗、新药的泛起、用药方法的改进使化疗疗效明显提高。当今抗肿瘤药物发展的重点之一是从天然药物中寻找活性成分，而我国有丰富的中药材资源以及数千年的中医中药理论与实践经验，对中药抗肿瘤作用的研究与开发前景良好。目前已筛选出一些并广泛应用于临床显示出良好的效果。维吾尔医学认为肿瘤患者表现为异常黑胆质性[1]，异常黑胆质成熟剂总黄酮(ASMq)对人肝癌细胞(HepG2)[2]、人宫颈癌细胞(Hela)、T 淋巴瘤细胞[3]、乳腺癌细胞[4]体外具有抗癌作用，但ASMq对急性白血病多药耐药细胞株的逆转研究尚属空白。本研究旨在了解ASMq对人慢性骨髓性白血病细胞(K562)及人白血病阿霉素耐药株(K562/ADR)是否存在细胞毒性作用。

1材料与方法

1.1仪器与试剂K562、K562/ADR细胞株由中国医学科学院天津血液病研究所提供。K562/ADR为阿霉素(ADR)长期诱导 K562敏感株而建立的耐药细胞株，阿霉素 (Adramycin, Adr)为深圳万乐药业有限公司产品。异常黑胆质成熟剂总黄酮(ASMq)由新疆奇康哈博维药有限公司提供。青霉素-链霉素双抗(10 000 U)为美国Hyclone公司产品。主要仪器：CO2细胞培养箱(上海力康仪器有限公司Smart Cell HF-90)，生物安全柜(上海力康仪器有限公司Neofuge 15R)，台式低速离心机(上海飞鸽仪器有限公司 TGL-16GB0)，流式细胞仪，液氮罐(日本尼康公司Eclise TS100-F)。

1.2方法

1.2.1试剂配制20%血清完全培养基：20 mL的胎牛血清加入90 mL的DMEM培养基中，添加1 mL的青-链霉素双抗溶液。无血清培养基：10 mL的DMEM高糖培养基，添加100 μL的青链-霉素双抗溶液(10 000 U)。20%DMSO细胞冻存液：2 mL的DMSO溶液加入8 mL的完全培养基中。阿霉素配制：将ADR用PBS配成2 mg/mL的溶液，0.22 μm滤膜过滤，PBS稀释。ASMq溶液配制：用灭菌水溶解ASMq，使其终浓度为12.5 mg/mL,0.22 μm滤膜过滤。

1.2.2细胞培养细胞复苏：从液氮中取出冻存的细胞，立刻置于37℃水浴中快速晃动冻存管使细胞快速解冻，倒置显微镜下观察细胞密度并接种到培养瓶中，37℃、饱和湿度、5%CO2细胞培养箱中培养。细胞传代：观察培养瓶(25 cm2)中细胞贴壁融合达90%时，即可进行细胞的传代，操作步骤如下：开启生物安全柜紫外消毒30 min，以75%乙醇擦拭台面灭菌，并预先准备3个细胞培养瓶(25 cm2)、15 mL离心管、无菌过滤的PBS、0.25%胰酶溶液、完全培养基，取出长满细胞的培养瓶，倒空瓶中的培养基，加入2 mL过滤灭菌的PBS缓冲液反复冲洗2遍，倒空PBS缓冲液，每瓶中加入1 mL的0.25%的胰酶溶液，使胰酶溶液平铺在细胞层面上，缓缓摇动细胞培养瓶，待细胞70%脱落时加入1 mL的完全培养基终止胰酶的消化作用，并用吸头反复冲洗培养瓶底将未脱落的细胞冲洗下来，转移液体至15 mL的离心管中，1 800 r/min离心5 min，小心吸弃离心管中的液体，并用1 mL的完全培养基重悬沉淀的细胞，倒置显微镜下观察细胞调整合适的细胞密度接种到培养瓶中,37℃、饱和湿度、5%CO2细胞培养箱中培养，6 h后持续观察细胞贴壁状态，待细胞达到50%～70%贴壁融合时倒空瓶中培养基，重新加入5 mL的含0.2 mm的完全培养基，继续培养。细胞冻存：消化、离心、重悬步骤同细胞传代，取1 mL的细胞重悬液，加入1 mL的20%DMSO的细胞冻存液颠倒混匀，并移至2 mL的冻存管中，冻存管中细胞经4℃(20 min)、-20℃(20 min)的程序降温后，转移至液氮中冻存。

1.2.3细胞株培养K562、K562/ADR细胞均用 RPMI1640 培养液(含10%胎牛血清、青霉素100 U/mL及链霉素100 μg/mL)，相对湿度95%、5% CO2培养箱中37℃培养, 2 d传代1次。K562/ADR细胞开始培养时使用无ADR完全培养基，细胞传2代后使用加入ADR的完全培养基(加ADR时首次加入750 ng/mL，再次传代后加入1 000 ng/mL，并确定后续培养的终浓度为1 000 ng/mL)，以维持其耐药性。

1.2.4ASMq对K562/ADR细胞的细胞毒性作用取对数生长期K562、K562/ADR细胞，96孔板中加入RPMI-1640培养液配制 5×104个/mL细胞悬液100 μL/每孔，37℃、5% CO2培养24 h 贴壁；后加入100 μL不同浓度(0、50、100、200、400、800和1 600( μg/mL)的ASMq 37℃共培养48 h，每组5个重复，按照CCK-8说明书检测细胞活性。

2结果

K562细胞株对不同浓度ASMq的细胞毒性的敏感性不同，差异有统计学意义；K562/ADR细胞株对不同浓度ASMq的细胞毒性的敏感性差异无统计学意义,结果见表1、图1～6。

浓度/(μg/mL)K562OD值K562/ADROD值00.264±0.011△○0.652±0.040500.260±0.014△○0.745±0.0651000.263±0.033△○0.683±0.1152000.246±0.020△○0.701±0.1274000.240±0.042△○0.714±0.1388000.078±0.0360.714±0.09416000.014±0.0030.670±0.102

注：与1 600 μg/mL组比较，△P<0.01； 与800 μg/mL组比较，○P<0.01。

3讨论

白血病是造血系统的恶性增殖性疾病，是严重威胁小儿生命和健康的疾病之一。小儿时期发生的白血病多为急性白血病。儿童白血病具有2个特点：一是恶性程度高，病情发展迅速，大多是急性发病的特点。儿童白血病的治疗以化疗为主，化疗的原则是多药联合和多疗程治疗，白血病细胞产生耐药性是目前白血病治疗失败的主要原因之一。目前认为耐药白血病的发生有2种可能：一种可能是原来存在于体内的耐药细胞亚群,随着敏感细胞被选择性杀死而逐渐聚集、增殖，并最终成为主要细胞群，此为原发性耐药；另一种可能是由于化疗药物诱导使细胞特性发生改变，导致耐药性的产生，此为继发性耐药。目前对中药抗肿瘤作用的研究与开发前景良好，维吾尔族医学也在积极寻找能够抗肿瘤的药物。异常黑胆质成熟剂(国家发明专利编号：C082130082.8)是维吾尔医复方制剂，由破布木(Cordia dichotoma Forst.)、红枣(Ziziphus jujuba Mill.)、甘草(Glycyrrhiza uralensis Fisch.)、牛舌草(Anchusa italica Retz.)、小茴香(Foeniculum vulgare Mill.)、锦草(Euphorbia humifusa Willd.)等药材组成，用于治疗由异常黑胆质所导致的肿瘤、糖尿病和心血管疾病等。其主要成分含糖、皂苷、酚、黄酮、生物碱、香豆素和/或内酯、有机酸和氨基酸等成分，其中异常黑胆质成熟剂总酚提取物对人急性早幼粒细胞白血病细胞株 (HL-60)增殖的抑制作用明显，对总酚提取物进行进一步分离，其中含总黄酮量最高的组分对HL-60细胞的抑制作用最强。

图1K562 96孔板加ASMq 400 μg/mL后48 h观察(×400)

图2K562/ADR 96孔板加ASMq 400 μg/mL后观察(×400)

图3K562 96孔板加ASMq 800 μg/mL后48 h观察(×400)

图4K562/ADR停药96孔板加ASMq后 800μg/mL观察(×400)

图5K562 96孔板加ASMq 1 600 μg/mL后48 h观察(×400)

图6K562/ADR停药96孔板加ASMq 1 600 μg/mL后观察(×400)

本研究观察了ASMq对K562及K562/ADR细胞株的细胞毒性及其与化疗药物的协同作用，结果显示，K562细胞株对不同浓度ASMq的细胞毒性的敏感性不同，提示ASMq对K562细胞有细胞毒性作用，而在0～1 600 μg/mL的浓度范围内对K562/ADR没有细胞毒性作用。肿瘤多药耐药是指肿瘤细胞在接受化疗过程中，一旦对某种化疗药物产生耐药性，便同时对其他结构上无关作用机制各异的药物均产生交叉耐药的广谱耐药现象[5]，根据试验结果提示K562/ADR对ASMq在0～1 600 μg/mL浓度范围内耐药。增加ASMq是否对K562/ADR细胞株有细胞毒性作用有待进一步研究。ASMq对K562细胞株的细胞毒性作用机制可能是异常黑胆质成熟剂中含有的总黄酮成分能调控凋亡基因的表达,能明显抑制肿瘤细胞生长,诱导肿瘤细胞凋亡[6-8]。近10多年来肿瘤的临床化学药物治疗进展较快，是综合治疗肿瘤的重要措施，但是目前化学药物还缺乏选择性作用。化学药物既能杀伤癌细胞，但因为其毒性较大，也会给机体带来损伤。中医中药能扶正培本，法邪解毒，提高免疫功能，既能减轻化疗的毒副作用，保护和防止机体正常组织细胞和脏器遭受化疗的伤害，又能增强机体免疫系统识别癌细胞，对化疗起增效作用，提高疗效。因此，中医药与化疗的结合，是进一步提高肿瘤治愈率的重要途径。动物实验研究表明，ASMq能够促进免疫细胞的生长和增殖，提高机体的免疫功能,增强免疫器官中抗氧化酶的活性,增强机体的抗癌能力[8-9]。

已有较多研究表明ASMq对宫颈癌细胞(Hela)、肝癌细胞(HepG2)、T 淋巴瘤细胞等多种癌变细胞的体外生长具有较明显的抑制作用。本研究表明ASMq对K562有细胞毒性作用，ASMq有可能成为临床治疗急性白血病的联合用药之一。但是在小剂量范围内对耐药细胞无细胞毒性作用，增加ASMq的剂量对耐药株是否有细胞毒性作用或耐药逆转作用尚有待进一步研究。

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(本文编辑周芳)