MN血型基因分型应用于河源地区临床输血检测*

黄 璐，刘丽华，庄运芳，陈丽红，欧小懂，梁延连

(1.河源市中心血站，广东河源 517000；2.深圳市血液中心，广东深圳 518035)

MNS血型系统是继ABO血型系统之后第二个被发现的血型系统，其复杂性仅次于Rh血型系统，迄今为止已发现47种抗原。在临床输血方面，MN血型具有重要意义，抗-M或抗-N抗体的存在可影响输血前交叉配血，甚至引起溶血性输血反应或新生儿溶血病[1]。在欧洲、美洲等许多发达国家已将红细胞MN血型鉴定作为临床输血的常规检测项目[2]。MN血型检测有血清学方法和基因分型方法，有报道由于抗体的特异性，大量输血患者或自身溶血性贫血患者检测MN血型时，采用血清学方法得到的结果并不完全可靠[3]。本文应用PCR-SSP基因分型技术鉴定因产生抗-M抗体影响交叉配血的患者样本的MN血型，成功解决交叉配血问题，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 样本 本实验室收集交叉配血困难的患者标本14例，经谱细胞鉴定血浆中均存在抗-M抗体。

1.2 试剂 单克隆IgM性质抗-M、抗-N血清及标准谱细胞试剂(上海血液生物医药公司)，抗人球蛋白试剂(美国Immucor公司)，DNA抽提试剂盒(美国QIAGEN公司)，PCR-SSP基因分型试剂盒(天津秀鹏生物技术公司)。

MN血型PCR-SSP基因分型试剂盒包括2种引物混合液：Mix-M与Mix-N，分别用于扩增M，N血型基因片段，其特异性扩增产物长度分别为162 bp和300 bp。试剂盒内参质控引物根据人类生长激素基因(HGH)的保守片段设计，存在于每个引物中，且在每次试验中运行，其特异性扩增产物长度为865 bp。

1.3 仪器 KA-2200血清学离心机(日本KUBOTA公司)、Eppendorf高速离心机(美国Eppendorf公司)，Eppendorf9700PCR扩增仪(美国Eppendorf公司)，Embitec电泳仪(美国Embitec公司)，D-77WWL-20M凝胶成像仪(美国Syngene公司)。

1.4 方法

1.4.1 血型血清学鉴定：选取已知MN血型表现型血样作阴、阳对照，严格按照试剂说明书进行MN血型血清学鉴定；抗体筛查鉴定试验参照文献[4]方法。

1.4.2 PCR-SSP基因分型

1.4.2.1 DNA提取：吸取全血血样300 μl，按照全血基因组DNA提取试剂盒说明书提取样本DNA。

1.4.2.2 PCR扩增体系：总反应体系10 μl，其中引物混合液8 μl；Taq酶(1∶10稀释)1 μl；模板DNA(浓度100 ng/L以上)1 μl。

1.4.2.3 PCR扩增参数：采用热启动技术，96℃2 min，96℃20 s，68℃60 s，5个循环；96℃20 s，65℃45 s，72℃30 s，10个循环；96℃20 s，62℃45 s，72℃30 s，15个循环；72℃3 min；降温至4℃完成PCR扩增。

1.4.2.4 扩增产物电泳及结果分析：取扩增产物各加1 μl荧光燃料后经2 g/dl琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，每个PCR反应都应产生强度一致的865 bp内对照产物，每孔均出现内对照则认为扩增成功。根据试剂盒规定的M,N血型基因PCR产物位置判定对应的基因型。

1.4.3 交叉配血：选择M抗原阴性的血液与患者进行盐水法及间接抗人球法[4]交叉配血试验。

2 结果

2.1 样本血清学与基因分型结果 见表1。14例样本血清学鉴定结果与基因分型结果一致，其中11例为NN型，2例为MN型，1例为MM型。12～14号3例存在M抗原的患者样本血浆中的抗-M抗体与自身的M抗原均不发生凝集反应，而与异体的M抗原发生特异性凝集反应。

表1 14例样本MN血型检测结果

2.2 基因分型结果 见图1。

2.3 配型结果 选择M抗原阴性的血液与该14例患者配血，盐水介质主、次侧无溶血、无凝集，抗人球介质主、次侧无溶血、无凝集。患者输血后无输血反应，24 h内血红蛋白上升。

(DNA Marker组成片段为：1 000，700，500，400，300，200，100bp。)

3 讨论

MNS血型系统在临床输血、新生儿同种免疫性疾病诊断、法医学、遗传学、干细胞移植等领域中起着重要作用。MN血型抗原在人出生时已发育成熟，据报道该血型系统抗原的功能涉及寄生虫、细菌和病毒感染等[5]。MN血型抗原对应的抗体都与输血反应有关，IgM抗-M可引起配血不合，M抗原阴性患者接受M抗原阳性血液，可能产生潜在不良反应。如果患者处于低温麻醉状态下手术时应注意，因为此类抗体可激活补体，当患者的体温在冷抗体最适反应温度范围内(4℃～20℃)时，可发生溶血反应。免疫性IgG抗-M可引起新生儿溶血病和溶血性输血反应。据上海等地大量筛查数据显示临床申请输血的患者抗-M抗体的检出率为0.73‰～1.23‰[6～8]，是继Rh血型系统抗体以外检出率最高的一种抗体。笔者前期调查显示河源地区MN血型的M和N基因频率分别为0.562 5和0.43 75，当地人群临床随机输血MN血型抗原不配合概率高达0.37 11[9]。临床输血中血型抗体的产生与相应抗原免疫原性的强弱及抗原不配合概率的高低密切相关，理论上，抗原不配合概率越高，输血次数越多，其潜在产生抗体的机会也越高，为保障输血安全，应考虑逐步将红细胞MN血型鉴定作为临床输血的常规检测项目。

MN血型系统的检测方法大多用传统的血清学方法，PCR技术也逐步用于MN血型系统的检测。血清学方法快速、经济、不受实验室条件等限制，可操作性强。但在大量输血、自身免疫性溶血性贫血等患者检测MN血型时，结果常难以确认，存在一定局限性。PCR-SSP基因分型法能直接确定基因型，所需样本量小，取材更广泛。但所需耗时长，需要配套的仪器，使其应用受到一定限制。上述两种方法均有一定的优势和局限性。笔者采用PCR-SSP基因分型及血清学方法同时对14例因产生抗-M抗体而影响交叉配血的患者样本进行MN血型鉴定，结果14例样本血清学鉴定结果与基因分型结果均一致。值得注意的是本文所选14例产生抗-M的样本中，有2例为MN型，1例为MM型，这3例血浆中的抗-M抗体均不与自身红细胞发生凝集反应，而与异体的M抗原发生特异性凝集反应。通常情况下，红细胞表面存在相关的抗原，则血浆中不应存在该抗原对应的抗体。对于红细胞上既有M抗原又产生相应抗-M抗体的现象，有研究[10]表明人类红细胞MNS血型中抗-M的产生与M抗原是否存在没有必然关联，与相关基因GYPA的表达也无明显关联。抗-M抗体除了由输血、妊娠等免疫产生以外，还可以由自然界的类M物质或细菌感染所致，特别对于烧伤患者或儿童更为常见。此外，亦有报道提出这类抗体的产生是否与M或N的亚型分型相关的疑问[11]。

临床上出现的抗-M抗体可以以不同性质出现，可以是IgM性质也可以是IgG性质，但只要患者的血浆中检出抗-M，如果需要输血，都应输注M抗原阴性的红细胞。

本文检测结果显示PCR-SSP基因分型方法与血清学方法可实现相互验证，基因分型方法可作为血清学方法的补充。

致谢：本课题得到深圳市血液中心卢亮书记、梁延连教授、苏宇清教授的技术支持与帮助，在此一并表示感谢！

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