胃癌相关甲基化分型与幽门螺杆菌感染的探讨*

朱卫华，刘继斌，林 兰(江苏省南通市肿瘤医院，江苏南通 226361)

胃癌(GC)是人类常见的恶性肿瘤之一，是全球癌症相关死亡的第二大原因[1]。胃癌预后差仍然是一个重要的临床挑战，它对放疗和化疗相对耐药因而治疗选择有限[2]。DNA甲基化(DNA methylation)是目前研究最为广泛、最重要的表观遗传修饰之一。肿瘤甲基化亚型，称为CpG岛甲基化表型(CIMP)，是指出现多基因的甲基化，目前认为是肿瘤新的预后标志[3，4]。胃黏膜幽门螺杆菌感染(H.pylori，HP)是胃癌的高风险因素，一些研究表明，幽门螺杆菌感染与基因启动子甲基化有关，且与肿瘤的发生发展有关[5，6]。我们重点关注了幽门螺杆菌感染与CpG岛甲基化表型(CIMP)在胃癌中的关系，分析了75例胃癌患者血清中相关基因CIMP状态(APC，WIF-1，RUNX-3，DLC-1，SFRP-1，DKK和E-cad)和幽门螺杆菌感染在胃癌预后中的价值。

1 材料与方法

1.1 研究对象 收集2008～2010年期间南通市肿瘤医院手术切除的经病理明确诊断的胃癌和相应的非癌临近组织以及配对的血清样本75例，男性53例，女性22例，年龄31～76岁，平均年龄52.35±7.62岁。2周内未行抗肿瘤治疗采集血样。健康体检者40例血清作为对照，男性18例，女性22例，2组人员均晨起空腹抽取外周静脉血。组织标本离体10min内取材，液氮速冻5 min后放置-70℃保存。血清标本，3 000×g离心5～10 min，取上层血清，-80℃低温冰箱冻存或立即抽提取DNA。

1.2 试剂和仪器

1.2.1 主要试剂：PCR产物纯化试剂盒(购自上海生工)，MSP mix(TaKaRa热启动酶系统)，离心柱型临床组织基因组DNA提取试剂盒(购自上海闪晶生物公司)，离心柱型临床血液基因组DNA提取试剂盒(上海闪晶生物公司)；琼脂糖(Amresco公司)，EZ DNA Methylation-Gold KitTM(美国ZYMO RESEARCH公司)。

1.2.2 主要仪器：德国Biometra温度梯度PCR扩增仪，ECPS3000/150电泳仪，BECKMAN AllegraTMRA 64R高速低温离心机，美国BIO-RAD公司凝胶图像分析仪，博日MiniRun凝胶电泳仪。

1.3 方法

1.3.1 血浆DNA提取：按上海闪晶生物公司临床标本基因组DNA抽提试剂盒说明书严格操作提取血浆DNA。收集到管内的核酸溶液，紫外分光光度计测定DNA含量，要求吸光度A260nm/A280nm≥1.8，4℃保存备用。

1.3.2 引物设计与合成：根据GenBank设计相关引物甲基化引物，由上海生工公司设计合成，引物序列见表1。

表1 7种基因甲基化引物

注：M.甲基化；U.未甲基化；F.前导链；R.后续链。

1.3.3 DNA甲基化处理：DNA甲基化处理采用美国ZYMO RESEARCH公司的EZ DNA Methylation-Gold KitTM试剂盒。严格按照说明操作。

1.3.4 幽门螺杆菌感染检测：幽门螺杆菌感染由血清幽门螺杆菌免疫球蛋白G抗体试验(PBM，普林斯顿，美国)和快速尿素酶试验(福建三强生物化工有限公司，三明，中国)检测。血清幽门螺杆菌免疫球蛋白G抗体试验和快速尿素酶试验的敏感度≥90%的幽门螺杆菌培养检测[7]。

1.3.5 所有病例术后进行了两年随访，最后一次随访是在2010年9月12日。患者术前未接受化疗。中位随访期是17.5个月(范围：8～28个月)。患者均给予体格检查、腹部超声、胸部X射线检查，收集血清，并进行相关肿瘤标志物检测。在第一年，对局部复发和远处转移，每3个月用CT/或MRI成像进行了监测。在75例患者中，13例(17.33%)死于肿瘤相关的原因。17例(22.67%)出现胃癌复发，14例(18.67%)出现胃癌转移。62例患者在最后一次随访时仍存活。

1.4 统计学分析 本资料采用SPSS 13.0统计软件，计数资料用百分数表示，采用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 临床相关资料 肿瘤大小平均为3.8 cm(范围2.5～9.6 cm)。据Edmondson-Steiner分期，分类为Ⅰ期6例，Ⅱ期22例，Ⅲ期40例，Ⅳ期7例。根据美国癌症联合委员会(AJCC)(格林，佛罗里达州等，2002年)第6版TNM分期，Ⅰ期24例，Ⅱ期31例，Ⅲ期20例。

分析了75例肿瘤病人以及健康对照组相关标本7种基因APC，WIF-1，RUNX-3，DLC-1，SFRP-1，DKK-3和E-cad启动子甲基化状况。结果显示：对照组均未发现相关基因启动子的甲基化改变，75例病人中有69例出现一个甚至多个基因的甲基化改变，胃癌组织和相关血液中相关基因甲基化频率均超过15%，其中APC在胃癌组织为48%，在血清为30.67%；WIF-1在胃癌组织为57.33%，在血清为34.67%；RUNX-3在胃癌组织为56%，在血清为37.33%；DLC-1在胃癌组织为50.67%，在血清为29.33%；SFRP-1在胃癌组织为52%，在血清为33.33%；DKK-3在胃癌组织为54.67%，在血清为32%；E-cad在胃癌组织为48%，在血清为26.67%。按照相关研究标准[8]，75例相关胃癌样本被分为CIMP+(≥3甲基化基因)或CIMP-(两个或更少的甲基化基因)。在本研究中，由于临界值为3，肿瘤组织中的甲基化基因数平均为3.6，而血清中的甲基化基因数为2。肿瘤组织样本中，47例(62.67%)样本被划分为CIMP+，28例(37.33%)被划分为CIMP—。血清样本中，44例(58.67%)被划分为CIMP+，31例(41.33%)被划分为CIMP-。非肿瘤组织和健康对照组血清均为CIMP-。

2.2 胃癌中幽门螺杆菌感染及相关资料 经检测发现75例胃癌样本中有51例(68%)幽门螺杆菌感染阳性，24例(32%)未感染。在51例幽门螺杆菌阳性胃癌组织中，发现36例CIMP+和15例CIMP-。而24例未感染胃癌组织中11例CIMP+，13例CIMP-。幽门螺杆菌阳性组和阴性组CIMP表达差异有统计学显著性意义(χ2= 4.27，P<0.05)，51例幽门螺杆菌阳性血清样本中，34例CIMP+和17例CIMP-；24例未感染血清样本中，10例CIMP+，14例CIMP-。两组间差异有统计学显著性意义(χ2= 4.21，P<0.05)。

2.3 CIMP在幽门螺杆菌感染的胃癌预后中价值 经过两年随访，有3例HP+/CIMP+病人失访；31例HP+/CIMP+病人中，有9例出现了转移，10例出现了复发，7例死亡；17例HP+/CIMP-病人中，有2例发生了转移，3例出现了复发，2例死亡；发现HP+/CIMP+和HP+/CIMP-两组转移率明显不同，HP+/CIMP+病人有转移倾向(χ2=3.593，P<0.05)；HP+/CIMP+组复发率明显高于HP+/CIMP-组(χ2=2.369，P<0.05)；生存率二者未见明显不同(χ2=1.043，P>0.05)。

3 讨论

近年来，表观遗传改变已被认为是肿瘤发生的重要早期事件[9]。富含CpG岛的DNA启动子区异常甲基化是表观遗传沉默的关键环节。异常基因表达可能是肿瘤的早期事件，是肿瘤早期发现的潜在生物标志物[10]。研究证实基因的异常甲基化可作为肝癌发生风险的筛选指标，基因的甲基化与预后明显相关[11]。也有研究认为基因甲基化检测在胃癌早期诊断中的价值很高，特异度高，是一种有效的诊断方式，在患者的临床诊断方面拥有广阔的治疗前景[12]。

研究发现，幽门螺杆菌感染的胃黏膜活检标本中DNA异常甲基化是胃癌高发的危险因素[13]，血液中白细胞的重复元件低甲基化与恶性胃黏膜病变以及胃癌进展相联系[13]。近年来，术语“CIMP”已被用于各种胃癌表观研究中。近年来幽门螺杆菌感染与多基因甲基化的关系已有了一些探讨，但很少有人关注CIMP与幽门螺杆菌与胃癌的关联或血清中CIMP与胃癌中幽门螺杆菌之间存在的关联。本研究中我们收集了胃癌病人的组织和血清以及健康对照的相关组织和血清并进行了7个肿瘤相关基因(APC，WIF-1，RUNX-3，DLC-1，SFRP-1，DKK-3和E-cad)CIMP状态的检测。我们发现对照组均未发现相关基因启动子的甲基化改变，胃癌组织和血清中相关基因甲基化频率均超过15%，也许多基因甲基化状态改变可能对胃癌的早期诊断具有一定帮助。我们还发现血清中DNA启动子区甲基化对肿瘤相关基因是高度特异的，并且与肿瘤组织结果是相似的。我们检测了75例胃癌样本中的CIMP状态，发现组织与血清具有很好的一致性。

75例胃癌样本中有51例(68%)幽门螺杆菌感染阳性，24例(32%)未感染。胃癌中幽门螺杆菌是很普遍的，这表明预防和治疗胃癌根除幽门螺杆菌感染可能是必要的。CIMP状况在肿瘤预后中的价值已在多种肿瘤中进行了论证，食管腺癌中，CIMP与预后不良相关[15]。幽门螺杆菌也是胃癌预后的一个因素，我们研究发现CIMP与幽门螺杆菌之间存在关联。幽门螺杆菌还可引起宿主DNA损伤并改变DNA甲基化干扰下游信号[16]。

经过两年随访，发现HP+/CIMP+和HP+/CIMP-两组转移率明显不同，HP+/CIMP+病人有转移倾向(P<0.05)；复发率HP+/CIMP+组明显高于HP+/CIMP-组(P<0.05)；生存率二者未见明显不同(P>0.05)。因此，异常的DNA甲基化可能与慢性炎症有关。多重的调控暗示DNA甲基化是在宿主对幽门螺杆菌感染的反应中扮演了一个重要角色。幽门螺杆菌通过降低DNA修复基因的表达促进遗传不稳定性[17]。经过两年随访后，我们发现HP+/CIMP+与胃癌病人的转移和复发相关，与生存关系不大。提示HP+/CIMP+参与了胃癌的发生发展过程，与生存无关也许是因为随访时间太短，结果有待进一步验证。

总之，我们研究发现胃癌患者血清DNA启动子区异常甲基化是具有很高的特异性的，并且与组织具有很好的一致性。因此血清中CIMP检测具有和组织中相似的结果，可以很好解决标本来源受限的相关病人的检测，并为预后的研究提供便利，解决临床实际标本困难。因而血清中CIMP检测是一个稳定的有用的胃癌预后监测指标。本研究由于研究病例相对较少，肿瘤相关基因也少，因而相关结果有待大样本证实。由于随访时间较短，仅仅两年，可能相关结论有些偏差，需要大样本长期随访进一步验证。

[1] Hohenberger P，Gretschel S．Gastric cancer[J]．Lancet．2003，362(9380)：305-315．

[2] An C，Choi IS，Yao JC，et al．Prognostic significance of CpG island methylator phenotype and microsatellite instability in gastric carcinoma[J]．Clin Cancer Res，2005，11(2)：656-663．

[3] Toyota M，Ahuja N，Suzuki H，et al．Aberrant methylation in gastric cancer associated with the CpG island methylator phenotype[J]．Cancer Res，1999，59(21)：5438-5442．

[4] Wang YC，Yu ZH，Liu C，et al．Detection of RA-SSF1A promoter hypermethylation in serum from gastric and colorectal adenocarcinoma patients[J]．World J Gastroenterol，2008，14(19)：3074-3080．

[5] Shin CM，Kim N，Jung Y，et al．Role ofHelicobacterpyloriinfection in aberrant DNA methylation along multistep gastric carcinogenesis[J]．Cancer Sci，2010，101(6)：1337-1346．

[6] Nakajima T，Yamashita S，Maekita T，et al．The presence of a methylation fingerprint ofHelicobacterpyloriinfection in human gastric mucosae[J]．Int J Cancer，2009，124(4)：905-910．

[7] Maekita T，Nakazawa K，Mihara M，et al．High levels of aberrant DNA methylation inHelicobacterpyloriinfected gastric mucosae and its possible association with gastric cancer risk[J]．Clin Cancer Res，2006，12(3pt1)：989-995．

[8] Weisenberger DJ，Siegmund KD，Campan M，et al．CpG island methylator phenotype underlies sporadic microsatellite instability and is tightly associated with BRAF mutation in colorectal cancer[J]．Nat Genet，2006，38(7)：787-793．

[9] Feinberg AP，Ohlsson R，Henikoff S．The epigenetic progenitor origin of human cancer[J]．Nat Rev Genet，2006，7(1)：21-33．

[10] Zhou X，Popescu NC，Klein G，et al．The interferon-alpha responsive gene TMEM7 suppresses cell proliferation and is downregulated in human hepatocellular carcinoma[J]．Cancer Genet Cytogenet，2007，177(1)：6-15．

[11] 陆海一，林 兰，刘继斌．拮抗Wnt信号通路的CpG岛甲基化表型在肝癌预后中的临床价值[J]．现代检验医学杂志，2013，28(6)：22-25．

Lu HY，Lin L，Liu JB．Clinical significance of CpG island methylator phenotype(CIMP)in plasma associated with prognosis in hepatocellular carcinoma[J]．Journal of Modern Laboratory Medicine，2013，28(6)：22-25．

[12] 李 颖，易 默，何小勤．Reprimo和hMLH1基因甲基化在胃癌早期诊断价值的研究[J]．现代检验医学杂志，2015,30(3)：53-55,59．

Li Y，Yi M，He XQ．Research on reprimo，hMLH1 gene methylation in early diagnosis value of gastric cancer[J]．Journal of Modern Laboratory Medicine，2015,30(3)：53-55,59．

[13] Niwa T，Tsukamoto T，Toyoda T，et al．Inflammatory processes triggered byHelicobacterpyloriinfection cause aberrant DNA methylation in gastric epithelial cells[J]．Cancer Res，2010，70(4)：1430-1440．

[14] Chen D，Zhang XR，Zhang Y，et，al．Hypomethylation of repetitive elements in blood leukocyte DNA and risk of gastric lesions in a Chinese population[J]．Cancer Epidemiol，2016(41)：122-128．

[15] Eads CA，Lord RV，Wickramasinghe K，et al．Epigenetic patterns in the progression of esophageal adenocarcinoma[J]．Cancer Res，2001，61(8)：3410-3418．

[16] Servetas SL，Bridge DR，Merrell DS．Molecular me-chanisms of gastric cancer initiation and progression byHelicobacterpylori[J]．Curr Opin Infect Dis，2016，29(3)：304-310．

[17] Sepulveda AR，Yao Y，Yan W，et al．CpG methylation and reduced expression of O6-methylguanine DNA methyltransferase is associated withHelicobacterpyloriinfection[J]．Gastroenterology，2010，138(5)：1836-1844．