深圳地区儿童A群致病性链球菌感染流行现状及M蛋白基因分型分析*

肖海军，殷晓晴，张慧莲，刘芹兰(.深圳市宝安区妇幼保健院检验科，广东深圳 58000；.深圳市龙华新区人民医院妇科，广东深圳 5809)

A群链球菌(group Astreptococcus，GAS) 又称酿脓链球菌，是引起儿童感染性疾病的重要致病菌。GAS感染除易引起咽炎、扁桃腺炎和皮肤化脓性感染外，还可引起严重的风湿热和肾小球肾炎等非化脓性疾病。近年来，全球GAS感染性疾病较严重[1，2]，已成为全球社会公共卫生问题，且不同emm基因型的GAS致病性也不同。因此，了解GAS感染流行现状及emm基因分型对其流行性研究具有重要意义。笔者就此对2014年3月～2015年12月临床送检的1 634例患儿标本进行了GAS感染现状及emm基因分型分析，现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 标本来源 收集2014年3月～2015年12月来本院门诊和住院就诊的急性咽炎、急性扁桃腺炎、风湿热、猩红热患儿咽拭子及皮肤化脓性感染伤口分泌物共1 634份。

1.2 仪器与试剂 5 ml/dl绵羊血TSA琼脂由英国Oxoid公司提供；氧化酶、触酶及0.4 u杆菌肽敏感试剂盒由青岛海博生物技术有限公司提供；Vitek32全自动微生物系统生化分析仪由法国biosMerieumx公司提供；基因扩增试剂均由广州金域医学检验中心提供。

1.3 方法

1.3.1 细菌分离培养及鉴定：将咽拭子标本震荡混匀后接种于含5 ml/dl绵羊血TSA(胰大豆蛋白胨)琼脂血平板上，放置于37℃5%～10%(v/v)CO2温箱内培养24～36h；挑取有透明溶血环的圆形单个菌落进行纯培养，革兰氏染色为革兰氏阳性(G+)链球菌，氧化酶和触酶试验结果为阳性，对可疑菌落以0.4 u杆菌肽敏感试验、Oxoid的乳胶凝集试验鉴定，Vitek32全自动微生物系统生化分析仪最终鉴定为GAS，所有操作均按细菌鉴定手册中的操作规程进行。

1.3.2 GAS基因组DNA提取：参照美国疾病预防控制中心(CDC)推荐方法：在平皿上用无菌接种环刮取新鲜生长的半环量的GAS培养物重悬于300 μl 0.85 g/dl的氯化钠生理盐水中，70℃水浴15 min，然后以5 000 r/min离心5 min弃去上清液，加50μl TE(10 mmol Tris，1 mmol EDTA，pH 8.0)，10 μl变溶菌素(3 000 U/ml)及2 μl玻璃质酸酶(30 mg/ml)，混匀后37℃水浴30 min，100℃煮沸10 min后离心上清液即为GAS基因分型组DNA，立即进行PCR或存储在-20℃以备使用。

1.3.3 GAS emm基因的扩增：根据emm基因5’端碱基组成特点设计引物：(F)TATTGGCTTAGAAAATTAA，(R)GCAAGTTCTTCAGC TTGTTT对GAS的M蛋白N末端进行PCR扩增；PCR扩增反应条件：50μl反应液中含有200μmol/L dNTP，浓度为20 μmol/L的引物1和引物2各1 μl，2 u Taq，25 μg DNA模板；30个循环：94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1.5 min，最后1次循环72℃引物延伸5 min。

1.3.4 PCR产物的测序：以测序引物TATTCGCTTAGAAATTAAAAACAGG为引物进行直接测序，委托广州金域医学检验中心基因诊断室进行测序。

1.3.5 序列分析：通过网络用BLAST软件分析所测序列与GenBank中序列的同源性(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)，以判断emm基因分型的结果，根据DNA序列同源性≥95%判为同一基因型的标准。

1.4 统计学方法 用SPSS 19.0统计软件进行数据分析，计数资料采用百分率(%)表示，组间比较采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同年龄儿童GAS感染率 见表1。1 634例患儿标本中共分离鉴定出61株GAS，检出率为3.73%(61/1 634)，其中学龄前和学龄儿童分别检出14株和47株，检出率分别为22.95%(14/61)和77.05%(47/61)，学龄儿童GAS感染率明显高于学龄前儿童，两者结果之间差异有统计学意义(χ2=32.035，P<0.01)，但学龄儿童不同年龄段GAS感染率之间比较差异无统计学意义(χ2=1.572，P>0.05)。

表1 61例不同年龄儿童GAS感染率(%)

注：*为<3岁组与>3岁组比较；#为3～7岁组与>7岁组比较。

2.2 A群致病性GAS感染疾病分布 见表2。

表2 61株致病性GAS感染疾病分布

急性咽炎、化脓性扁桃体炎、急性风湿热及急性肾小球肾炎等疾病患儿GAS检出率较高，以急性咽炎和化脓性扁桃体炎为最高，分别为34.43%(21/61)和27.87%(17/61)。

2.3 GAS emm基因分型分布情况 见表3。61株GAS菌株 emm基因分型中，基因型以emm l为主，占40.98%(25/61)，其次为emm 12，占29.51%(18/61)。

表3 61株GAS emm基因分型分布情况

3 讨论

A群链球菌(group AStreptococcus，GAS)为G+链球菌，细菌壁含有多种蛋白抗原(M，T和R)、磷壁酸、及多糖抗原。GAS是儿童细菌性感染重要病原菌之一，主要可引起咽炎、扁桃体炎、猩红热及皮肤软组织感染，反复感染可继发风湿热、风湿性心脏病、关节炎和急性肾小球肾炎等，应充分重视。

以前认为，GAS易感染3岁以上儿童，引起咽炎和扁桃体炎，3岁以下儿童GAS性咽炎和扁桃体炎不常见。但近几年研究发现3岁以下婴幼儿GAS感染引起的咽炎、扁桃体炎也日益增加[3]。本研究结果显示，3岁以下儿童GAS感染也有一定比率，为22.95%，但明显低于3岁以上学龄儿童的感染率(77.05%)，两者感染率之间比较差异有统计学意义(P<0.01)，这可能与3岁以下儿童机体内自身免疫机制还没完全建立有关。由于GAS含多种毒素和酶类，其感染可导致人体多种局部化脓性和非化脓性炎症。因此，提高对GAS感染婴幼儿的认识，对预防GAS感染婴幼儿具有重要意义。而本区婴幼儿GAS感染率略低于黎国强等[3]报道广东省新兴地区的23.5%，这除与不同地区婴幼儿机体内免疫力不同外，还可能与家长及一些早教机构的照看方式不同有关。

本研究结果显示，急性咽炎和急性化脓性扁桃体炎患儿GAS检出率最高，高达27.86%～34.43%，略低于黎国强等[3]报道的28.5%～38.8%。由于GAS感染的发病机理比较复杂，而且GAS感染引起的风湿热、肾炎和坏死性筋膜炎等严重威胁人体的生命安全。因此，咽拭子GAS培养应该广泛应用于可疑的急性咽炎和急性扁桃体炎患儿检查中，建议最好将GAS培养纳入急性咽炎和急性化脓性扁桃体炎患儿常规检查项目之一，及早发现及时治疗，以防漏诊和误诊。

GAS emm基因分型可了解GAS感染流行菌株的分布状况，有利于选择流行菌株，从而构建适合本地基因工程疫苗的研究，制造相应疫苗来防治病原菌感染。本研究结果显示，61株GAS菌株emm基因分型中，以emm l和emm 12为主，分别为40.98%和29.51%。因此， GAS emm1和emm12基因类型可初步认定为本地区目前儿童感染GAS流行菌株，与国内相关报道[3～10]均不一致，这说明了不同地区GAS 感染流行的emm基因型均不相同。不同地区都应该进行GAS emm基因型的相关调查分析，为各地预防GAS感染流行的基因疫苗工程研究提供科学依据。

综以上述，深圳地区儿童GAS感染有一定的检出率，且3岁以下婴幼儿也有较高的GAS检出率，应引起当地医疗行政部门高度重视。GAS emm1和emm12基因型可初步认定本地区目前儿童感染GAS流行菌株，在临床治疗和预防过程中，除安全合理选用抗生素外，还要定期对高发区和易感人群进行链球菌感染普查，根据GAS emm基因型分型研究开发一种安全有效的GAS疫苗，为本地区GAS疫苗研制提供依据。

[1] Carapetis JR，Steer AC，Mulholland EK，et al．The gl-o-bal burden of group AStreptococcaldiseases[J]．Lancet Infect Dis，2005，5 (11)：685-694．

[2] 钱海坤，杨 鹏，张 奕，等．2005～2010年北京市猩红热发病时空扫描分析[J]．疾病监测，2011，26(6)：435-438．

Qian HK，Yang P，Zhang Y，et al．Spatial-temporal scan statistic on scarlet fever cases in Beijing,2005～2010[J]．Disease Surveillance，2011，26(6)：435-438．

[3] 黎国强，谭志伟，李 云，等．广东省新兴地区儿童致病性A组链球菌emm基因测序分型的研究[J]．国际医药卫生导报，2009，15(24)：1-3．

Li GQ，Tan ZW，Li Y，et al．Pathogenic group AStreptococcusemm gene sequencing typing study in xinxing Guangdong provine[J]．International Medicine Health Gudance News，2009,15(24)：1-3．

[4] 崔京辉，苗 元，胡晓芬，等．2011～2013年北京市西城区儿童A组溶血性链球菌的emm基因分型[J]．中国卫生检验杂志，2014，24(14)：2048-2050,2056．

Cui JH，Miao Y，Hu XF，et al．Genotyping of emm gene in group A hemolyticStreptococcusfrom children in xicheng district of Beijing from 2011 to 2013[J]．Chin J Health Lab Tec，2014，24(14)：2048-2050,2056．

[5] 王兆娥，封会茹，余 红，等．北京市丰台区2011～2014年A组乙型溶血性链球菌emm基因分型及耐药基因分析[J]．公共卫生与预防医学，2015，26(5)：22-24．

Wang ZE，Feng HR，Yu H，et al．Study on emm genotyping and drug-resistance of group AStreptococcuspyogens in fengtai,Beijing(2011～2014)[J]．Journal of Public Health and Preventive Medicine，2015，26(5)：22-24．

[6] 王海滨，温 雯，王恒伟，等．2011年北京市朝阳区儿童A组溶血性链球菌的emm基因分型及耐药性分析[J]．疾病监测，2012，27(6)：424-427．

Wang HB，Wen W，Wang HW，et al．Study on emm genotyping and drug-resistance of group AStreptococcusprogens isolated from children in chaoyang,Beijing,2011[J]．Journal of Disease Surveillance，2012，27(6)：424-427．

[7] 丁月霞，倪琼琼，刘金来．广州市儿童致咽炎β溶血性链球菌的流行情况及其emm基因分型[J]．中山大学学报(医学科学版)，2011，32(3)：411-414．

Ding YX，Ni QQ，Liu JL．Prospective surveillance ofStreptococcalsore throat for Guangzhou children[J]．Journal of Sun Yat-Sen University(Medical Science)，2011，32(3)：411-414．

[8] 赵成松，马耀玲，林弘睿，等．儿童链球菌感染分离株emm分型及超抗原基因谱的变迁[J]．实用儿科临床杂志，2012，27(22)：1730-1744．

Zhao CS，Ma YL，Lin HR，et al．Changes of emm types and superantigens ofStreptococcuspyogens isolated from children[J]．Journal of Applied Clinical Pediatrics，2012，27(22)：1730-1732,1744．

[9] 梁云梅，常贺生，沈叙庄，等．致儿童咽扁桃体炎酿脓链球菌emm分型[J]．临床儿科杂志，2011，29(4)：382-385．

Liang YM，Chang HS，Shen XZ，et al．Emm typing toStreptococcuspyogens isolated from children with adenopharyngitis[J]．Journal of Clinical Pediatrics，2011，29(4)：382-385．

[10] Liu X，Shen X，Chang H，et al．High macrolide resistance inStreptococcuspyogenes strains isolated from children with pharyngitis in China[J]．Pediatr Pulmonol，2009，44(5)：436-441．