1,25-二羟维生素D3对人系膜细胞增殖作用的影响

·论著·

1,25-二羟维生素D3对人系膜细胞增殖作用的影响

杨锐,尹璇,张昊,陈建平,马莉,张春江,杨晓萍

作者单位：832000新疆石河子市，石河子大学(杨锐,尹璇,张昊,陈建平,马莉)；石河子大学第一附属医院肾病科(张春江,杨晓萍)

通信作者：杨晓萍，832000新疆石河子市，石河子大学第一附属医院肾病科；E-mail:sbkyxp@163.com

【摘要】目的通过观察1,25-二羟维生素D3〔1,25(OH)2D3〕对Ki-67抗原表达的影响，探讨其对人系膜细胞增殖的抑制作用。方法体外培养人肾小球系膜细胞，随机分为正常对照组、表皮生长因子(EGF)组、1,25(OH)2D3组及EGF联合1,25(OH)2D3组，培养48 h后，应用免疫荧光技术和荧光定量PCR(RT-PCR)检测Ki-67抗原及其mRNA的表达。结果正常对照组、EGF组、1,25(OH)2D3组和EGF联合1,25(OH)2D3组细胞荧光强度分别为(35.958±2.563)、(49.872±2.745)、(22.415±2.277)和(36.567±2.270)，4组比较差异有统计学意义(F=123.429，P<0.05)。其中，EGF组荧光强度高于正常对照组，1,25(OH)2D3组荧光强度低于正常对照组(P<0.05)；1,25(OH)2D3组和EGF联合1,25(OH)2D3组荧光强度低于EGF组(P<0.05)。以正常对照组为基准，EGF组、1,25(OH)2D3组和EGF联合1,25(OH)2D3组Ki-67 mRNA相对表达量分别为(2.479±0.150)、(0.584±0.031)和(1.176±0.017)，4组比较差异有统计学意义(F=51.107，P<0.05)。其中，EGF组Ki-67 mRNA相对表达量高于正常对照组，1,25(OH)2D3组Ki-67 mRNA相对表达量低于正常对照组(P<0.05)；1,25(OH)2D3组和EGF联合1,25(OH)2D3组Ki-67 mRNA相对表达量低于EGF组(P<0.05)。结论1,25(OH)2D3可抑制人肾小球系膜细胞的增殖，并降低EGF对人肾小球系膜细胞增殖的促进作用。

【关键词】人肾小球系膜细胞；1,25-二羟维生素D3；Ki-67抗原；表皮生长因子；细胞增殖

基金项目：国家自然科学基金资助项目(81160090)

【中图分类号】R 692.31

收稿日期：(2015-03-12；修回日期：2015-08-29)

杨锐,尹璇,张昊,等.1,25-二羟维生素D3对人系膜细胞增殖作用的影响[J].中国全科医学，2015，18(35)：4330-4332.[www.chinagp.net]

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Effect of 1,25(OH)2D3on the Proliferation of Human Glomerular Mesangial CellsYANGRui,YINXuan,ZHANGHao,etal.MedicalCollegeofShiheziUniversity,Shihezi832000,China

Abstract【】ObjectiveTo investigate the effects of 1,25-dihydroxyvitamin D3〔1,25(OH)2D3〕 on Ki-67 antigen expression in human glomerular mesangial cells and its inhibitive effect on human glomerular mesangial cell proliferation.MethodsGlomerular mesangial cells were cultured in vitro and divided into normal control group,epidermal growth factor group(EGF group),1,25(OH)2D3group and combined group of EGF and 1,25(OH)2D3.After culture for 48 hours,the expression and the mRNA expression of Ki-67 antigen were measured using immunofluorescence technique and RT-PCR.ResultsThe cell fluorescence intensity was (35.958±2.563),(49.872±2.745),(22.415±2.277) and (36.567±2.270) for normal control group,EGF group,1,25(OH)2D3group and combined group respectively，with significant difference among them(F=123.429，P<0.05).EGF was higher than normal control group in fluorescence intensity(P<0.05),and 1,25(OH)2D3group was lower than normal control group in fluorescence intensity(P<0.05)；1，25(OH)2D3group and combined group were lower than EGF group in fluorescence intensity(P<0.05).With normal control group as standard,the relative expression levels of EGF group,1,25(OH)2D3group and combined group were(2.479±0.150),(0.584±0.031)and(1.176±0.017)respectively,with significant difference among them(F=51.107，P<0.05).EGF group was higher than normal control group in the mRNA relative expression level of Ki-67 antigen(P<0.05),1,25(OH)2D3group was lower than normal control group in the mRNA relative expression level(P<0.05);1,25(OH)2D3group and combined group were lower than EGF group in the mRNA relative expression level(P<0.05).Conclusion1,25(OH)2D3can inhibit the proliferation of human glomerular mesangial cell proliferation and reduce the facilitation of EGF for human glomerular mesangial cell proliferation.

【Key words】Human mesangial cells；1,25-Dihydroxyvitamin D3；Ki-67 antigen；Epidermal growth factor；Cell proliferation

系膜增生性肾小球肾炎(MsPGN)为临床常见的原发性肾小球肾炎之一，其特征为系膜细胞(MC)的增殖和基质积聚，最终导致终末期肾病。探讨MsPGN的发病机制及相应的治疗措施，对改善患者的预后极为重要[1]。有研究表明，增殖的或非增殖的肾小球均有Ki-67抗原、增殖细胞核抗原(PCNA)和拓扑异构酶Ⅱ α等增殖标志物表达[2]。其中，与细胞核增殖相关的Ki-67抗原可在神经干细胞、肿瘤细胞、系膜细胞等多种细胞中表达，是被广泛用于细胞增殖标志物的蛋白质[3-4]。新近研究表明，1,25-二羟维生素D3〔1,25(OH)2D3〕可抑制肾小球细胞增殖，调节系膜细胞免疫机制，拮抗Thy-1.1大鼠肾炎模型炎症浸润，诱导相应的凋亡反应，促进肾功能修复[5]。本研究探讨1,25(OH)2D3对人肾小球系膜细胞增殖及Ki-67抗原表达的影响，为1,25(OH)2D3临床的广泛应用提供理论依据。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1细胞株人肾小球系膜细胞株(4200)购于湘雅医学院中心实验室。

1.1.2试剂及仪器低糖DMEM、胰蛋白酶购于美国Gibco公司；胎牛血清购于杭州四季青生物有限公司；青链霉素混合液、DMSO购于北京索莱宝生物科技有限公司；1,25(OH)2D3、表皮生长因子(EGF)购于美国Sigma公司；小鼠抗人β-actin单克隆抗体、兔抗人Ki-67抗原单克隆抗体购于Cell Signaling公司；山羊抗兔IgG二抗、山羊抗小鼠IgG二抗购于北京中杉金桥生物技术有限公司；SybrGreen PCR Master Mix购于美国 ABI公司；Zeiss LSM510-META共聚焦显微镜购于德国蔡司公司；定量PCR仪购于瑞士罗氏公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养及分组用含10%胎牛血清的DMEM完全培养基复苏人肾小球系膜细胞，取传代培养至第3～8代细胞用于实验，采用随机数字表法将其分为正常对照组、EGF组、1,25(OH)2D3组和EGF联合1,25(OH)2D3组。正常对照组加含5%胎牛血清的DMEM培养基，EGF组加10 μg/L的EGF培养液(含5%胎牛血清DMEM培养基)，1,25(OH)2D3组加10-8mol/L的1,25(OH)2D3培养液(含5%胎牛血清DMEM培养基)，EGF联合1,25(OH)2D3组加10 μg/L 的EGF及10-8mol/L的1,25(OH)2D3培养液(含5%胎牛血清DMEM培养基)，48 h后收集细胞。

1.2.2细胞免疫荧光技术检测Ki-67抗原表达将细胞种于盖玻片上，置于6孔培养板，按照实验分组方法培养细胞，取出盖玻片，吸弃培养液，4%多聚甲醛固定30 min，3‰ Triton破膜20 min，封闭后加一抗，置湿盒入4 ℃冰箱过夜，加荧光二抗避光孵育1 h，除封闭外，其余各步均需用0.01 mol/L PBS洗3次，每次5 min，甘油封固，激光共聚焦显微镜观察并采图，测定荧光强度。实验重复3次。

1.2.3荧光定量PCR检测Ki-67抗原表达按照实验分组培养细胞，提取总RNA，反转录cDNA，引物序列：上游：5′-CCCCATTCACCCACCTTG-3′，下游:5′-TGATGTCACCTGGCTCCC-3′。β-actin内参基因引物序列：上游：5′-TAGTTGCGTTACACCCTTTCTTG-3′,下游:5′-TCACCTTCACCGTTCCAGTTT-3′。PCR参数：95 ℃变性3 min，95 ℃退火15 s，60 ℃延伸40 s，共进行40个循环。采用相对定量法计算Ki-67 mRNA相对表达量=2-ΔΔCt，其中ΔΔCt=(待测组目的基因Ct值-待测组内参基因Ct值)-(基准组目的基因Ct值-基准组内参基因Ct值)。

2结果

2.1人肾小球系膜细胞形态及生长情况正常对照组细胞胞体透亮，形态呈梭形、不规则星形、树枝状，胞质较清楚；EGF组细胞形态与正常对照组比较无明显改变，但细胞数目增多；1,25(OH)2D3组呈现一定程度的细胞凋亡，胞核皱缩，形态不清晰，数目较正常对照组明显减少；EGF联合1,25(OH)2D3组细胞形态及生长情况、数目与正常对照组大致相同。

2.2细胞免疫荧光技术检测Ki-67抗原表达正常对照组、EGF组、1,25(OH)2D3组和EGF联合1,25(OH)2D3组细胞荧光强度分别为(35.958±2.563)、(49.872±2.745)、(22.415±2.277)和(36.567±2.270)，4组比较差异有统计学意义(F=123.429，P<0.05)。其中，EGF组荧光强度高于正常对照组，1,25(OH)2D3组荧光强度低于正常对照组(P<0.05)；1,25(OH)2D3组和EGF联合1,25(OH)2D3组荧光强度低于EGF组(P<0.05，见图1)。

2.3Ki-67 mRNA相对表达量以正常对照组为基准，EGF组、1,25(OH)2D3组和EGF联合1,25(OH)2D3组Ki-67 mRNA相对表达量分别为(2.479±0.150)、(0.584±0.031)和(1.176±0.017)，4组比较差异有统计学意义(F=51.107，P<0.05)。其中，EGF组Ki-67 mRNA相对表达量高于正常对照组，1,25(OH)2D3组Ki-67 mRNA相对表达量低于正常对照组(P<0.05)；1,25(OH)2D3组和EGF联合1,25(OH)2D3组Ki-67 mRNA相对表达量低于EGF组(P<0.05)。

注：A为正常对照组，B 为EGF组，C为1,25(OH)2D3组，D为EGF联合1,25(OH)2D3组

图1各组细胞Ki-67抗原表达的免疫荧光染色结果(×400)

Figure 1Results of immunofluorescent staining of the expression of Ki-67 antigen of each group

3讨论

Ki-67抗原是细胞增殖的生物标志物，存在于除有丝分裂G0期之外的细胞周期各阶段，其阳性表达预示细胞增殖进入细胞周期[8]。研究发现，在乳腺癌、贲门癌患者中Ki-67抗原表达增高，而抑制Ki-67 抗原的表达可改善患者预后[8-10]。因此，Ki-67抗原的转录和表达水平可反映1,25(OH)2D3对细胞增殖的抑制作用。本研究结果显示，与正常对照组比较，经1,25(OH)2D3干预的人肾小球系膜细胞细胞核Ki-67抗原及其mRNA表达降低，提示1,25(OH)2D3不仅可从蛋白水平抑制Ki-67抗原的表达，也可从核酸水平抑制Ki-67抗原的表达，从而抑制人肾小球系膜细胞的增殖。

EGF在体内外对多种组织细胞有强烈促分裂作用。Kumar等[11]研究发现，EGF可刺激系膜细胞的增殖。本研究采用EGF诱导人肾小球系膜细胞增殖的微环境，并用1,25(OH)2D3进行干预，进一步观察在EGF诱导系膜细胞增殖的情况下，1,25(OH)2D3是否能抑制系膜细胞的生长与增殖。结果显示，与EGF组比较，1,25(OH)2D3联合EGF组人肾小球系膜细胞细胞核Ki-67抗原及其mRNA表达降低，1,25(OH)2D3可以抑制EGF作用下的人肾小球系膜细胞中的Ki-67抗原的表达。

综上所述，1,25(OH)2D3可抑制人肾小球系膜细胞的增殖，并降低EGF对人肾小球系膜细胞增殖的促进作用。本研究为体外实验，1,25(OH)2D3影响人肾小球系膜细胞增殖的具体机制有待进一步研究。

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(本文编辑：吴立波)