新型酵母培养物的制备及其在断奶仔猪生产上的应用研究

■张 丽 丁宏标

(中国农业科学院饲料研究所，北京100081)

酵母培养物含有丰富的营养物质，通过自身所含的活性成分调节宿主免疫功能、改善胃肠道营养与菌群平衡，对宿主产生有益的生理作用。其应用从反刍动物到单胃动物以及水产动物，都有较好的生产效果，尤其是反刍动物应用最多[1-2]。在酵母培养物的研制过程中，产品质量的优劣主要是由菌种性能的好坏决定的。如今，市面上可用于酵母培养物制作的酵母菌种很多，由于不同种属间菌种性能差异巨大，同种属不同菌株间也存在较大差异，其对瘤胃发酵和动物机体产生不同效应[3]。因此，优良的酵母菌株是酵母培养物研究与应用的基础。在兴起的微生态制剂研究领域，人们重视作用机理的研究和作用效果的对比，但对菌株的选择和性能比较未做过多的研究。

神曲又称六神曲，是由面粉或麸皮和五种中药在自然条件下发酵而成的一种曲类中药。它是应用最广泛的传统中药之一，也是中国药典中最早被记录的药物之一，主要用于治疗消化不良、呕吐、腹泻等症状[4]。酸面团是一种民间传统的馒头面团发酵剂，也用作发酵黄酒等酒曲，是由谷物、水和具有活性的微生物（酵母菌和乳酸菌）经自然发酵而成。这两种传统曲剂均是活菌培养物，微生物群落多样，且都含有制备酵母培养物的菌种，即酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。目前，未曾有研究表明神曲和酸面团中的酵母菌株对动物生产是否有积极的作用效果。

本文从传统神曲和酸面团中分离出两株酿酒酵母，结合现代发酵工艺制备一种酵母培养物，并将其应用到仔猪生产中，探索其对仔猪生长性能、营养物质利用和粪便微生物的作用效果。

1 材料与方法

1.1 材料

蛋白胨（奥博星）、葡萄糖（北京化工）、酵母提取物（奥博星）、琼脂（奥博星）、麦芽汁培养基（奥博星）、MRS琼脂培养基（奥博星）、麦康凯琼脂培养基（奥博星）、神曲和酸面团购买于市面。DNP-9082型电热恒温培养箱（上海精宏实验设备有限公司）、三目生物显微镜（NiKON）、LX-B35 L型立式高压蒸汽灭菌锅（合肥华泰医疗设备有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 菌种分离鉴定

将神曲和酸面团各10 g分别加入200 ml YPD液体培养基中，无菌条件下30℃培养24 h后，摇匀，用无菌生理盐水梯度稀释，选取10-6、10-7、10-83个稀释度，准确吸取0.1 ml稀释液均匀涂布于YPD固体培养基上，30℃恒温培养箱中培养48 h，分别从两种曲剂中挑取一种类似酿酒酵母的典型单菌落于YPD液体培养基中，30℃下培养24 h后划线分离2～3次，将纯培养物转YPD固体斜面培养基上培养12 h后，置于4℃低温冰箱保藏。从神曲和酸面团分离到的菌种分别标记为SY和JY。将分离到的菌种进行分子鉴定，确定菌种。

1.2.2 菌种ITS区序列分析

以制备的总 DNA为模板，以引物 ITS1(5’-TCC⁃GTAGGTGAACCTGCGG-3’)和ITS4(5’-TCCTCCGCT⁃TATTGATATGC-3’)扩增菌株，50 μl PCR 体系重复3 管。PCR反应体系为：10×Buffer 5 μl、dNTP 4 μl、MgCl24 μl、引物（10 μM）各1 μl、模板DNA 40～50 ng、Ex Tag（Takara，大连）1.5 U、灭菌超纯水补齐至50 μl。扩增条件：95 ℃ 5 min，95 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72℃ 1.5 min，35个循环；72℃ 10 min。PCR产物以DL2000为分子质量标准，在1.5%琼脂糖凝胶，120 V电压条件下电泳20 min检测，并送往北京市生化鉴定中心进行序列分析。

1.2.3 酵母培养物制备

利用YPD培养基分别接种两环纯化好的两种菌株于液体培养基中，30℃、200 r/min摇床培养12 h，得种子液。然后按照5%的添加量，将两种种子液分别添加到麦芽汁培养基中进行液体有氧发酵，30℃、200 r/min摇床发酵24 h。最后按10%的添加量将两种发酵液，以1∶1的比例，添加到由麸皮、面粉和豆粕等组成的固体培养基中混匀，密封瓶口，放于30℃静置发酵48 h。将所制得的酵母培养物均匀散于瓷盘中，放于室温，自然风干。粉碎过40～60目筛，即为复合酵母培养物。含酵母菌数4×106CFU/g、酒石酸9.6 mg/g、苹果酸5.8 mg/g、柠檬酸5.6 mg/g。

1.2.4 YC对保育猪生长性能的影响

选择健康、平均体重为（15.7±0.26）kg的“杜×长×大”三元杂交生长猪90头，按体重、性别基本一致的原则随机分为2组，每组3个重复，每个重复15头。对照组（control）饲喂基础日粮；酵母培养物组（YC）饲喂基础日粮+5 g/kg YC，试验期为35 d。测定指标有平均日增重、平均日采食量、料重比、腹泻率、养分消化率以及粪便微生物。试验采用的基础日粮为参照NRC（1998）配制的粉状饲料，饲料的常规原料根据猪场实际情况而定，其组成及营养水平见表1。试验猪舍为封闭、半漏缝地板式。试验猪按猪场常规程序进行免疫、驱虫、消毒和管理等，自由采食和饮水。

1.2.5 数据处理

采用SPSS 19.0软件的one-way ANOVA程序进行单因素方差分析，以Duncan's法进行多重比较，P＜0.05为差异显著。结果以“平均值±标准差”表示。

2 结果

2.1 酵母菌的分子鉴定

表1 基础日粮组成及营养水平（风干基础）

以制备的总DNA为模板，以真菌ITS区通用引物ITS1和ITS4作为上下游引物，扩增菌株ITS区片段，PCR电泳检测结果见图1。将扩增的PCR产物送至北京市生化鉴定中心进行分子鉴定，在NCBI-Gen⁃Bank数据库中，应用BLAST工具与已登陆的酵母DNA序列进行比对。结果显示，待测菌株与标准模式菌株的同源性均在99%以上，SY和JY GenBank登录号分别为KJ729284.1和AM262831.1。

图1 两株酵母菌PCR扩增

2.2 YC对保育猪生长性能、营养物质消化率和粪便微生物的影响（见表2、表3、表4）

表2 YC对仔猪生长性能的影响

表3 YC对仔猪营养物质消化率的影响(%)

表4 YC对仔猪粪便微生物的影响[lg(CFU/g)]

试验结果表明，在仔猪日粮中添加YC可提高平均日增重7.2%，提高平均日采食量1.74%，降低料重比5.45%(P＞0.05)。显著提高了仔猪对能量和干物质的消化率(P＜0.05)，对有机物、粗蛋白、粗脂肪以及磷消化低于对照组(P＞0.05)，而中性洗涤纤维和钙的消化则显著低于对照(P＜0.05)。且显著增加肠道乳酸菌数量和降低大肠杆菌数量，从而使仔猪腹泻率极显著降低(P＜0.01)。

3 讨论

3.1 酵母培养物的制备

现代用于制备酵母培养物的主要菌种为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，其来源主要通过筛选或基因工程获得优良品种。研究表明，传统中药神曲中含有大量的霉菌、细菌以及酵母菌，传统酸面团中主要菌种为酵母和乳酸菌[5-6]。本试验从市售的神曲和酸面团中，通过分子鉴定获得两株酿酒酵母。中国传统自然发酵制得的神曲和酸面团与现代酵母培养物有相同之处，均是由谷物、水和微生物在一定条件下发酵而成。但传统神曲和酸面团都是自然条件下发酵而成，环境中微生物均参与发酵，群落复杂多样，造成质量参差不齐。酵母培养物则是将特定菌种接种于特制培养基中，经过特定的现代发酵工艺进行优化发酵而成，其营养物质丰富，且效果稳定。利用现代发酵工艺，将传统发酵产生的菌种进行最优化处理，使其发挥最大优势，可能是探索新型酵母培养物的一条途径。

3.2 YC对仔猪生长性能的影响

YC含有丰富的营养物质以及促生长因子，许多研究已证实，YC可以提高断奶仔猪的生长性能。Mathew[7]等研究表明，日粮添加YC有助于提高断奶仔猪的ADG和ADFI。本实验表明YC组，对仔猪平均日增重及采食量没有显著变化(P＞0.05)，仅比对照组分别提高了7.2%和1.74%。但显著减少了仔猪的腹泻率(P＜0.01)。这与 van der Peet-Schwering等[8]研究结果相一致。原因可能是当时环境、日粮等对仔猪的免疫机能造成影响而导致的。van Heugten等[9]研究解释了动物在高疾病应激下，YC可能会通过触发肠道免疫应答与免疫系统的相互作用而使吸收的能量向免疫功能方向流动，非生长方向。

3.3 YC对仔猪养分消化率的影响

E.Pinloche等[10]表示在生长猪饲粮中添加YC，能刺激其后肠的发酵，使挥发性脂肪酸产量和细菌发酵终产物增加，从而提高猪的养分利用率。Y.B.Shen等[11]研究表明，YC可显著提高断奶仔猪对CP、干物质、能量的消化率(P＜0.05)，钙、磷的消化率则不显著(P＞0.05)。本试验研究结果证实，YC对总能和干物质消化率显著高于对照组(P＜0.05)，对有机物、粗蛋白、粗脂肪以及磷消化低于对照组(P＞0.05)，而粗纤维和钙的消化则显著低于对照(P＜0.05)。这与前人研究结果有相同之处，亦有不一致的效果。这也可能是由于菌剂、日粮、品种等不同造成的。

3.4 YC对仔猪粪便微生物的影响

微生态制剂的主要目的是向动物机体植入外源益生菌或改善其内源菌群，从而达到促生长的效果。本实验结果显示，YC能显著减少仔猪肠道大肠杆菌数量和增加乳酸菌菌数(P＜0.05)，且两者比值也显著比对照组降低(P＜0.05)，这与 Aditya Upadrasta等[12]研究结果一致。可能与日粮引起的应激有关，YC中酵母多糖抑制有害菌对肠道定植，且其中含的营养物质为肠道有益菌繁殖提供强大的动力，从而改善胃肠环境。但是YC组生长性能未见显著提高，这也验证了Scheurmann等[13]的研究结论，即活菌制剂对肠道微生物菌群平衡的改善作用不一定能反映在生产性能上。

4 结论

从传统曲剂神曲和酸面团中分离得到的两株酵母菌种，经分子鉴定确定为酿酒酵母，将其结合现代发酵工艺，制备一种酵母培养物。应用于仔猪生产中，表明该酵母培养物对仔猪生长性能有提高趋势，可显著增加日粮中总能和干物质的消化吸收，且可显著降低仔猪的腹泻率，改善肠道微生物菌群。该新型复合YC对断奶仔猪生长性能及肠道健康有一定效果，为微生态制剂发展提供了帮助。