北虫草素对体外小鼠肝癌H22细胞增殖及肝癌鼠血清中IL-2/TNF-α水平的影响

2016-01-09张莉莉,陈伟,梁国强

吉林中医药 2015年2期

张莉莉1，陈伟2，梁国强2*

(1.苏州市立医院(本部)门诊药房,江苏苏州 215000；2.苏州市中医医院吴门医派研究院，江苏苏州 215000)

摘要：目的探讨北虫草素对体外培养的小鼠肝癌H22细胞的增殖和H22荷瘤肝癌小鼠血清中IL-2和TNF-α水平的影响。方法分别用5，10，20，40，80 mg/L的北虫草素处理H22细胞48 h后，应用MTT法检测细胞的增殖抑制率；采用细胞接种的方法建立H22肝癌小鼠动物模型，随机分成5组，每组8只,双抗体夹心法(ELISA)检测小鼠血清IL-2和TNF-α数值。结果北虫草素呈剂量依赖性抑制H22细胞增殖(F=105.333，P<0.001)；环磷酰胺组、北虫草素中高剂量组小鼠瘤重显著低于对照组(P<0.01)，抑瘤率分别为55.60%，32.94%，43.94%。与对照组比较，北虫草素中高剂量组IL-2及TNF-α在血清中的表达均显著升高,差异均有统计学意义(P<0.05或0.01)。结论北虫草素能明显抑制荷瘤小鼠肿瘤生长，增强机体的免疫功能。

关键词：北虫草素；抗肿瘤；免疫功能；IL-2；TNF-α；小鼠

DOI:10.13463/j.cnki.jlzyy.2015.02.027

中图分类号：R285.5文献标志码： A

文章编号：1003-5699(2015)02-0184-03

基金项目:2012年苏州市“科教兴卫”青年科技项目(SS1326)。

作者简介:张莉莉(1976-)，女，大学本科，主管中药师，主要从事中药学及中药成分分析。

收稿日期:(责任编辑：赵玉芝2014-07-03)

*通信作者:梁国强，电话-13584809803，电子信箱-616250366@qq.com

Effects of North Cordyceps on proliferation of hepatoma-22 cells in vitro and IL-2/TNF-α

in serum on Hepatic Cancer Mice

ZHANG Lili1,CHEN Wei2,LIANG Guoqiang2

(1.Outpatient pharmacy,Suzhou Municipal Hospital,Suzhou 215000,Jiangsu Province,China;

2.Suzhou Hospital of Traditional Chinese Medicine,Institute of Wumen Traditional Chinese Medicine,

Suzhou 215000,Jiangsu Province,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the effect of North Cordyceps on proliferation of hepatoma-22 cells in vitro and IL-2/TNF-α in serum on Hepatic Cancer Mice.MethodsMTT was employed to detect proliferation ability of H22 cells treated with 5，10，20，40，80mg/L North Cordyceps for 48 h,respectively,the model of hepatoma-22 Hepatic Cancer Mice were established by the cell inoculation Method,and the animals were randomly divided into 5 groups.8 rats in each group were pick up randomly.The number of IL-2 and TNF-α were detected by Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA).ResultsThe proliferation inhibtion rate of North Cordyceps on H22 cells were enhanced in a dose-dependant manner (F=105.333,P<0.001).The inhibiting rate of Cyclophosphamide group,cordycepin in the Middle,high dose group was 55.60%,32.94% and 43.94% by using analysis of variance method,which was obviously lower than control group (P<0.01).Compare with control group the expression of IL-2 and TNF-α in serum was increased in cordycepin in the middle,high dose group.The difference between two groups had statistical significance (P<0.05 or 0.01).ConclusionNorth Cordyceps could obviously inhibit the growth of tumor and enhance the immune functions in bearing mice.

Keywords:North Cordyceps;antitumor;immunological function;IL-2;TNF-α;mice

虫草素(cordycepin)是迄今为止发现的唯一的天然核苷类抗生素，也是自然界相对富集的天然抗癌抗生素，虫草素即3-脱氮腺苷，为含氮配糖体的核酸衍生物，属嘌呤类生物碱，有抗病毒，抗肿瘤作用，尤其对多种实体恶性肿瘤有很强的抑制作用[1]。北虫草(蛹虫草)与冬虫夏草为虫草属的同属异种真菌，两者的化学成分、营养成分和药用功能均非常相似，其主要药用成分虫草素等含量远高于野生冬虫夏草，而且比冬虫夏草更易于人工栽培[2-3]。对北虫草(蛹虫草)化学成分的提取、分离、鉴定及药理作用虽已有较多研究，但对于其化学成分北虫草素与药理活性关系还有待进一步深入研究[4-5]。原发性肝癌(primary hepatic carcinoma，PHC)是常见的消化系统恶性肿瘤之一，笔者以体外小鼠肝癌H22细胞和肝癌H22细胞荷瘤小鼠为实验模型[6-7]，观察从人工蛹虫草中提取的北虫草素对小鼠肝癌H22细胞生长的抑制作用以及对肝癌H22细胞荷瘤小鼠在体抑制瘤体作用，同时观察其对瘤鼠血清中IL-2和TNF-α水平的影响。

1实验材料

北虫草素由南京中医药大学植物药深加工中心应用人工蛹虫草提取，人工蛹虫草由南通市海安县泓寿生物科技有限公司提供。小鼠肝癌H22细胞株,由南京中医药大学药学院药理实验室惠赠。BALB/c小鼠，体质量18～22 g，购自昭衍(苏州)新药研究中心有限公司，雌雄各半。RPMIDMEM培养基：美国Gibco公司；小牛血清购自杭州四季青生物有限公司;胰蛋白酶闪晶生物有限公司；四甲基偶氮唑蓝(MTT)AMRESCO;环磷酰胺(CTX)购自江苏恒瑞医药股份有限公司；IL-2和TNF-α ELISA试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

2实验方法

2.1北虫草素体外对H22细胞生长的影响将处于对数生长期的H22细胞调整密度为1×105个/mL，接种于96孔细胞培养板，24 h后,分别加入不同质量浓度的北虫草素，使其终质量浓度分别为5，10，20，40，80 mg/L，同时设对照组。每组设6个复孔，置37 ℃、体积分数5%CO2饱和湿度的培养箱中培养48 h后，每孔加入5 g/L的MTT溶液20 μL，继续培养4 h，每孔加入150 μL DMSO，振荡10 min，于570 nm波长处测各孔的吸光度(A)值，计算细胞的抑制率[8]=[(1-A)(给药孔)/A(对照孔)]×100%。

2.2小鼠移植性肿瘤模型的建立及给药收集肝癌H22细胞株，低速离心(10 000 r/min，5 min)3次，调整细胞密度为1×106个/mL，台盼蓝检测细胞的存活率。将细胞(存活率≥95%)悬液0.2 mL注射至BALB/c小鼠右腋皮下，全程严格无菌操作[9]。24 h后采用随机数字表法分5组(n=8)，即荷瘤对照组，环磷酰胺对照组及北虫草素15、30、60 mg/kg 3个剂量组。同时设1组为不接种瘤株的生理盐水正常对照组，正常与荷瘤空白对照组给予腹腔注射同体积的生理盐水，环磷酰胺对照组给予20 mg/kg，各组均以10 mL/kg的体积连续腹腔给药14 d，第15天麻醉，眼眶取血分离血清备用，小鼠断髓处死,剥离瘤体,称重。

2.3检测指标动物体重增长率(%)=(给药组增重-对照组增重)/对照组增重×100%；抑瘤率(%)=(荷瘤对照组平均瘤重-给药组平均瘤重)/荷瘤对照组平均瘤重×100%)；血清IL-2和TNF-α检测，各组小鼠取血1 mL，不加抗凝剂，置于一次性离心管内，以3 000 r/min，5 min，取血清置于-20 ℃保存。采用ELISA法测定，操作步骤按照试剂盒说明进行。

3结果

3.1北虫草素对H22细胞增殖抑制作用的影响见表1。

表1　北虫草素对H 22细胞增殖作用的影响 ± s)

3.2北虫草素对荷瘤小鼠体质量增长率的影响给药前后除环磷酰胺组荷瘤鼠的体质量增加的幅度较对照组明显小(P<0.001)，其他各组体质量均正常增加,而北虫草素高剂量组增重明显高于对照组(P<0.05)。说明环磷酰胺能够损伤、加重荷瘤鼠的恶病质体质，导致其体质量增加出现异常，而北虫草素高剂量改善荷瘤鼠的恶病质体质,提高生存质量。见表2。

3.3北虫草素对抑瘤率的影响由表3结果表明虫草素抑瘤效果未能达到临床一线抗癌药物环磷酰胺的效果；其抑制肿瘤生长的效果与其剂量成依赖性梯度关系。

表2　各剂量组对荷瘤小鼠动物体质量增长率的影响 ± s)

注：与空白对照组比较，# P<0.05，### P<0.001

注：与空白对照组比较，##P<0.01，###P<0.001

3.4北虫草素各剂量组对H22荷瘤鼠血清IL-2和TNF-α水平的影响由表4结果可见，与荷瘤对照组相比,各给药组能显著提高荷瘤小鼠血清IL-2水平。与荷瘤对照组相比，各北虫草组均提高荷瘤小鼠血清TNF-α水平；与空白、正常对照组相比,环磷酰胺组小鼠血清TNF-α水平显著降低(P<0.001,表中未标记出)。提示环磷酰胺可能存在损伤荷瘤小鼠免疫因子TNF-α，而北虫草素可能对免疫指标的损伤存在保护、改善的作用,这种作用也存在剂量依赖的关系。

组别n剂量/(mg/kg)IL-2/(pg/mL)TNF-α/(pg/mL)空白组 8-154.7±28.4##62.4±4.2## 对照组 7097.2±25.1 47.3±5.3 环磷酰胺组620110.4±19.5# 18.9±1.6###北虫草素低715115.7±27.5# 50.4±3.8 北虫草素中830128.5±30.5# 68.4±5.7# 北虫草素高860145.7±32.1##73.5±4.3##

注：与空白对照组比较，#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001

4讨论

蛹虫草[Cordycepsmilitaris(L.)Link]为子囊菌亚门，麦角菌目，麦角菌科、虫草属的模式种。经成分测定分析及药理实验证明可作为冬虫夏草的替代品之一。蛹虫草中主要活性成分虫草素是虫草中特有的活性成分，具有明显的镇静、抗疲劳、抗肿瘤、抑制癌细胞和促使雄性激素分泌等作用，可增强机体免疫功能。根据蛹虫草化学成分及药理作用研究进展[10-11]，从其中提取的北虫草素作为一种用途广泛的新药来开发是必然的趋势[12-13]。

参考文献：

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[8]王丽萍,曾宪旭,牛凤兰,等.五倍子酸对小鼠胃癌MFC和肝癌H22细胞增殖的抑制作用[J].郑州大学学报:医学版,2012,47(3):339-341.

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