头针结合艾灸对缺血缺氧性脑损伤幼鼠学习记忆能力及脑内BDNF的影响

头针结合艾灸对缺血缺氧性脑损伤幼鼠学习记忆能力及脑内BDNF的影响

周钰1,牛相来1,林子歆1,方丽娜1,周伟1,霍新慧2*

(1.新疆医科大学第一附属医院，乌鲁木齐 830054；2.新疆医科大学，乌鲁木齐 830054)

摘要：目的观察头针结合艾灸对脑瘫幼鼠学习记忆能力的作用以及对脑源性神经生长因子(BDNF)的影响。方法7日龄清洁级新生SD幼鼠7窝共40只，随机分为假手术组(A组)、模型组(B组)、头针组(C组)、艾灸组(D组)和头针结合艾灸组(E组),造模成功后，采用头针、艾灸治疗2周后，对幼鼠的运动功能进行评价，行为学观察各组幼鼠Y迷宫实验结果;术后18 d通过免疫组化法检测大脑皮质BDNF阳性表达结果。结果假手术组Y迷宫实验耗时和BDNF阳性表达结果均低于模型组；各治疗组之间比较,Y迷宫实验结果头针结合艾灸组(67.71±7.60)优于头针组(74.73±8.06)(P=0.39<0.05)和艾灸组(81.18±10.1)(P=0.00<0.01);BDNF阳性表达结果头针结合艾灸组(20.46±2.03)与头针组(18.95±1.62)相比,P=0.43<0.05。结论治疗组均能改善幼鼠的学习记忆能力和提高BDNF阳性表达结果，以头针结合艾灸组效果最好；头针结合艾灸治疗可以提高BDNF水平的表达并发挥其生物活性，从而促进神经功能缺损的恢复，改善学习记忆能力。

关键词：头针；艾灸；缺血缺氧性脑损伤；BDNF；幼鼠

DOI:10.13463/j.cnki.jlzyy.2015.02.026

中图分类号：R245.32文献标志码： A

文章编号：1003-5699(2015)02-0181-03

基金项目:新疆乌鲁木齐市科技厅资助项目(Y121310018)。

作者简介:周钰(1972-)，女，硕士，副主任医师，主要从事针灸治疗脑病的研究。

收稿日期:(责任编辑：赵玉芝2014-07-08)

*通信作者:霍新慧，电话-13565908032，电子信箱-349532885@qq.com

Effect of scalp acupuncture combined moxibustion on learning and memory ability with

hypoxic-ischemic brain damage rats and brain BDNF

ZHOU Yu1,NIU Xianglai1,LIN Zixin1,FANG Lina1,ZHOU Wei1,HUO Xinhui2*

(1.The First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University,Urumqi 830054,China;

2.Xinjiang Medical University,Urumqi 830054,China)

Abstract:ObjectiveObserved scalp acupuncture combined with moxibustion on learning and memory ability of rats with cerebral palsy as wellas for brain-derived neurotrophic factor (BDNF) impact.Methodshypoxic-ischemic brain damage in young rats were randomly divided into sham operation group (A),model group (group B),scalp acupuncture group (group C),moxibustion group (group D) and Scalp combined with moxibustion group (E),Using scalp acupuncture,moxibustion treatment after two weeks,motor function of rats to evaluate the behavior observed in young rats in each group Y maze test results;18d after by immunohistochemical assay cerebral cortex BDNF expression results.ResultsThe sham group Y maze consuming and BDNF expression results were lower than the untreated group;Comparison,Y maze test results scalp acupuncture combined with moxibustion group(67.71±7.60) than among the treatment groups scalp acupuncture group (74.73±8.06)(P=0.39<0.05) and moxibustion group (81.18±10.1)(P=0.00<0.01),BDNF expression results scalp acupuncture combined with moxibustion group (20.46±2.03)compared with scalp acupuncture group (18.95±1.62),P=0.43<0.05.ConclusionThe treatment group rats can improve learning and memory ability and increase the BDNF expression results to scalp acupuncture combined with moxibustion group best effect;Scalp therapy combined with moxibustion can increase the level of expression of BDNF and exert their biological activity,thus contributing to the recovery of neurological deficit,improve learning and memory abilities.

Keywords:scalp acupuncture;moxibustion;hypoxic-ischemic brain injury;BDNF;rat

新生儿缺氧缺血性脑损伤(hypoxic-ischemicbrain damage,HIBD)是由于出生前或出生时缺氧所造成的，患儿多留有脑瘫、癫痫等神经系统后遗症[1]。目前，对于新生儿缺氧缺血性脑损伤的有效治疗方法一直是国内新生儿科学的研究热点。本实验以脑源性神经生长因子(Brain-derived neurotrophic factor，BDNF)基因蛋白表达为指标，结合幼鼠学习记忆能力的观察，探讨头针结合艾灸治疗的脑保护作用机制。

1材料与方法

1.1实验动物与分组7日龄清洁级新生SD幼鼠7窝共40只，雌雄不拘,体质量11.4～17.2 g，平均(13.9±2.5) g，动物由新疆医科大学实验动物中心提供，动物许可证号:FYXK(新2003-0001)，所有幼鼠自由摄食和饮水，生活在昼夜节律为12 h/12 h且保持一定湿度和25 ℃的空间内。随机分为假手术组(A组)、模型组(B组)、头针组(C组)、艾灸组(D组)和头针结合艾灸组(E组)各8只。BDNF蛋白免疫组化检测试剂盒和DBA显色剂试剂(武汉博士德生物工程有限公司)，华佗牌不锈钢一次性毫针，规格0.30 mm×25 mm(苏州医疗用品有限公司)。

1.2模型制备5组幼鼠在氯胺酮复合麻醉剂麻醉状态下，在手术显微镜下，A组仅分离颈总动脉不结扎，B、C、D、E 4组分离左颈总动脉并结扎，均缝合切口。术后复苏30 min将幼鼠放入37 ℃的恒温密闭的缺氧箱中，以1 L/min的速度通入低氧气体(体积浓度为8%的氧气和92%的氮气)2 h后取出，继续保温1 h后送回母鼠笼中自由饮食[2]。

模型成功判定方法采用Longa评分法进行神经行为学评定：1)无神经损伤症状为0分；2)不能完全伸展手术对侧前爪或后爪为1分；3)行走时，向手术对侧转圈为2分；4)行走时，向手术对侧倾倒为3分；5)不能自发行走，意识丧失为4分。将得分为2～3分的幼鼠视为成功模型。

1.3实验方法

1.3.1头针治疗头针选穴依据《头针国际标准化方案》,选取顶颞后斜线、顶颞前斜线，根据华氏介绍的大鼠穴位图谱[3]并模拟人体经穴定位。顶颞后斜线:“百会”至“曲鬓”(“百会”穴在顶骨正中点，“曲鬓”穴为耳缘直上与耳尖水平线的交点)；顶颞前斜线：顶颞后斜线向前平移0.1寸。直径0.25 mm×25 mm毫针常规消毒,针体与皮肤成15°角至帽状腱膜下。30 min/次，1次/d，期间捻转3次，每次1 min,以200 r/min速度捻针。

1.3.2艾灸治疗选穴百会、夹脊、足三里，参照标准同前。艾条温和灸，5 min/穴，1次/d。

1.3.3头针结合艾灸治疗：上述头针治疗与艾灸治疗同时进行。

1.4行为学测试幼鼠在术后16 d进行Y迷宫训练,术后17 d进行Y迷宫试验测定。Y迷宫训练使幼鼠训练至各个方向都能最终到达。参数调节：电压50～60 V,延时5 s。实验前先将幼鼠放入迷宫中适应3～5 min，然后以无规则次序变换安全区。幼鼠受电击后逃到安全区后，灯光继续作用10～15 s。然后，以幼鼠所在支臂就作为下一次测试的起始位置进行下一次测试。记录幼鼠从打开灯到逃到安全区所需时间。每只检测3次，取平均值,评定脑瘫幼鼠学习记忆能力。

1.5免疫组化检测于术后18 d分别取出各组幼鼠,10%水合氯醛腹腔麻醉，切开胸腔，心脏快速灌流生理盐水100 mL，然后用4%多聚甲醛50 mL灌流固定。参照《大鼠脑立体定位图谱》取前额2 mm至视交叉部位的脑片进行脱水、浸腊、包埋、切片、烤片、烘片、脱蜡、免疫组织化学染色。BDNF阳性反应定位在胞膜/胞浆,呈棕黄色或棕褐色。显微镜下(40×10倍)对每张切片任选5个不重叠视野进行摄像。测量每个视野内阳性细胞数,再计算该切片平均阳性细胞数。

1.6统计学方法采用SPSS 16.0统计软件进行统计学处理，多样本计量资料进行单因素方差分析(ANOVA-one way)，方差不齐时，用近似F检验，两两比较采用LSD法。

2结果

2.1Y迷宫实验结果各组反应时间明显小于B组(P<0.01),C、D、E组之间比较，C组大于E组(P=0.39<0.05)，D组也大于E组(P=0.00<0.01),说明各治疗组均能改善幼鼠的学习记忆能力，但以头针结合艾灸组效果最好，见表1。

表1　各组幼鼠Y迷宫实验结果

注：各组与B组比较，#P<0.01；C、D与E组之间比较，△P<0.05，△△P<0.01

2.2BDNF基因蛋白阳性表达结果A组明显小于B组(P=0.003<0.01),C、D、E组均明显大于B组；治疗组之间比较，C组小于E组(P=0.43<0.05)。

表2　各组幼鼠BDNF阳性表达结果

注：各组与B组比较，#P<0.01；C、D与E组之间比较，△P<0.05，△△P<0.01

3讨论

研究表明，针灸治疗能改善缺血性脑卒中患者的神经功能缺损程度,提高ADL和认知能力[4]。艾叶及其生成物具有清除自由基和过氧化脂质的作用，艾的燃烧生成物可附着在皮肤上并渗透进去，而起到治疗疾病的作用[5]。针灸治疗可促进脑电活动和神经递质分泌，改善血液供应，改善脑细胞功能[6]。脑源性神经营养因子(BDNF)对脑损伤的影响是现在研究脑部疾病的一个热点，广泛分布于中枢神经系统，对神经元的存活、分化、生长发育起着重要作用，并能防止神经元受损后死亡、改善神经元的病理状态、促进受损伤神经元再生及分化等生物效应[7]。杜继平[8]强调采用调和阴阳针刺法治疗痉挛型脑瘫，龙于飞[9]指出经筋的通利与否及督脉的气血运行状况与小儿脑瘫的发生和发展有重要的关联，通过理筋通督推拿法以醒神开窍可作为治疗小儿脑瘫的重要方法。刘振寰等[10]研究表明：神经生长因子注射能促进脑功能的代偿作用，都为针刺治疗脑瘫提供了理论参考。

本研究为了探索头针结合艾灸对缺血缺氧性脑损伤幼鼠学习记忆能力及脑内BDNF基因蛋白表达的影响，在中医基础理论的指导下，以头针和艾灸作为干预手段，以缺血缺氧性脑损伤幼鼠为研究对象，对幼鼠的学习记忆能力综合评定，对幼鼠BDNF阳性表达结果对比分析，把中医的整体观念、辨证论治应用到微观的、具体的物质中去，深入探讨针灸治疗小儿脑瘫作用机理。我们的研究发现，头针、艾灸疗法均可有效的改善HIBD幼鼠学习记忆能力，增强BDNF基因蛋白的表达，但以二者的联合治疗效果更佳，这与临床治疗小儿脑瘫综合疗法优于单一疗法的临床实践一致。此外，头针结合艾灸治疗可以提高BDNF基因蛋白水平的表达并发挥其生物活性，从而保护中枢神经系统对抗自由基和抑制神经细胞凋亡，促进受损神经细胞功能恢复，进而促进神经功能缺损的恢复。这可能是头针结合艾灸治疗可以促进HIBD幼鼠学习记忆能力改善的机理之一。

参考文献：

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[8]杜继平.调和阴阳针刺法配合运动训练治疗痉挛型脑瘫临床观察[J].吉林中医药,2010,30(1):53-54.

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[10]刘振寰,祁岩超,潘佩光,等.针灸合神经生长因子对脑瘫患儿脑功能代偿的影响[J].中国针灸,2007,27(8):565-568.