黄芪注射液影响人恶性黑色素瘤细胞凋亡的实验研究

黄芪注射液影响人恶性黑色素瘤细胞凋亡的实验研究

王俭，胡溪恬，刘巧，杨颖，杨恺瑞,胡秀华*

(北京中医药大学，北京 100029)

摘要：目的探讨黄芪注射液在体外对人恶性黑色素瘤A375细胞凋亡的影响。方法应用DAPI荧光染色观察黄芪注射液作用后A375细胞凋亡情况，设对照组；流式细胞仪检测黄芪注射液对A375细胞凋亡率的影响；分光光度法检测黄芪注射液作用后A375细胞中caspase-3蛋白活性情况。结果与对照组相比，黄芪注射液处理组荧光显微镜下可以见到明显的凋亡小体，且呈时间和质量浓度依赖；同时发现黄芪注射液可使A375细胞凋亡率明显升高，并呈浓度依赖性；caspase-3蛋白活性检测发现,100,200 mg/mL的黄芪注射液不影响Caspase-3的活性，300，400 mg/mL的黄芪注射液降低Caspase-3的活性。结论黄芪注射液有诱导人恶性黑色素瘤细胞A375细胞凋亡的作用，其诱导黑色素瘤凋亡是通过影响Caspase-3蛋白非依赖性途径实现的。

关键词：黄芪注射液；恶性黑色素瘤细胞；细胞凋亡；Caspase-3

DOI:10.13463/j.cnki.jlzyy.2015.04.030

中图分类号：R285.5文献标志码： A

文章编号：1003-5699(2015)04-0407-03

基金项目:国家自然

作者简介:王俭(1991-)，男，硕士研究生，主要从事中医临床，肿瘤学研究。

收稿日期:(责任编辑：赵玉芝2014-05-28)

*通信作者:胡秀华，电话-(010)64286976，电子信箱-xiuhuahu@126.com

Effects of Astragalus Injection on Human Melanoma A375 Cells Apoptosis

WANG Jian,HU Xitian,LIU Qiao,YANG Ying,YANG Kairui,HU Xiuhua*

(Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100029,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the effects of Astragalus injection on apoptosis and apoptotic factors of human melanoma A375 cells in vitro.MethodsDAPI stain method and flow cytometry were applied to observe apoptotic body and apoptotic ratio of A375 cell.Spectrophotography was used to examine the activity of caspase-3.ResultsCompared with the control group,the typical apoptotic bodies were observed under the fluorescence microscope in a time and concentration-dependent manner.The apoptotic ratio were obviously increased by Astragalus injection in a concentration-dependent manner.Moreover,we found activity of caspase-3 in Astragalus injecton with 100 and 200 mg/mL doses was no influence,in A375 cells treated by Astragalus injection with 300 and 400 mg/mL doses was lower than control and other doses.ConclusionApoptosis of A375 cells could be induced by Astragalus injection in a Caspase-3 activity-independent pathway.

Keywords:astragalus injection;human melanoma A375 cells;Cell apoptosis;Caspase-3

黄芪具有“补气健脾，升阳举陷，益卫固表，利尿消肿，托毒生肌”作用[1]。其主要成分为黄芪多糖、黄芪皂甙、葡萄糖醛酸，并含有多种微量元素，可用于肿瘤的治疗[2-4]。黄芪注射液是从黄芪中提取的有效成分精制而成，作为提高人体免疫力的药物，已得到广泛运用。本研究采用黄芪注射液为研究用药，探讨其对人恶性黑色素瘤A-375细胞凋亡的影响。

1实验材料

黄芪注射液，购自中神威药业有限公司，每毫升含生药2 g。实验时，取黄芪注射液适量，加入培养基相应量，将黄芪注射液无菌配制至终浓度为100，200，300，400 mg/mL。人恶性黑色素瘤A-375细胞株，购于中国协和医科大学细胞中心。将A-375细胞置于37 ℃、5%CO2培养箱中，用新鲜配制的含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基常规培养，用0.25%胰蛋白酶消化传代，每2～3 d传代1次。DMEM高糖培养基、0.25%胰蛋白酶、及胎牛血清(Hyclone公司，美国)，碘化丙啶PI(Sigma，美国)，4’，6-二脒基-2-苯基吲哚染液(DAPI,Sigma，美国)，RNA酶(Sigma，美国)，BCA法蛋白定量试剂盒(普利莱公司，中国)，Caspase-3分光光度法检测试剂盒(南京凯基，中国)。CO2培养箱(BINDER)，酶标仪(Bio-Tek，美国),流式细胞仪(BD，美国)，荧光显微镜(OLYMPUS)。

2实验方法

2.1荧光显微镜观察A-375细胞的凋亡情况将A-375细胞置于37 ℃、5%CO2培养箱中用新鲜配制含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基中常规培养，取对数生长期的细胞,以1×104个/mL浓度接种于24孔板，待细胞贴壁24 h后吸除原培养液，实验组每孔分别加入500 μL含不同浓度的黄芪注射液，终浓度分别为100，200，300 mg/mL，每组设3个复孔；对照组加入等量的生理盐水，设3个复孔，分别培养48 h,72 h后吸除原培养液，用预冷的PBS洗2遍,加入用生理盐水配成的1 μg/mL的DAPI染液，进行DAPI染色，常温避光作用5 min,用PBS洗2遍后置荧光显微镜下观察A-375细胞及细胞核的形态并拍照。

2.2流式细胞术检测A-375细胞的凋亡率将A-375细胞接种于培养瓶中,待80%细胞汇合成片后，分别吸除原培养液，实验组加入不同浓度的黄芪注射液，终浓度分别为200，300，400 mg/mL；对照组加入等量生理盐水，48 h后收集细胞，冷PBS洗涤细胞(1 000 r/min，5 min)，加入1 mL 4 ℃、75%乙醇，轻轻吹打混匀后于4 ℃过夜，离心3 min(1 000 r/min)，吸除上清，再加入1 mL 4 ℃生理盐水重悬细胞，离心3 min(1 000 r/min),吸除上清，加入50 μg/mL的PI、50 μg/mL的RNA酶1:1混合液1 mL，避光10 min后上机检测分析细胞的凋亡率。

2.3Caspase-3活化程度测定收集实验组(用终浓度分别为100，200，300，400 mg/mL的黄芪注射液处理)和对照组的细胞，用PBS洗涤2次，离心(2 000 r/min,5 min)，尽量吸除PBS上清。在收集的沉淀中分别加入100∶1的LysisBuffer与DTT混合液100 μL，在冰上裂解1 h，其间斡旋震荡4次，每次10 s，后离心(4 ℃，10 000 r/min，1 min)，吸取上清即样品备用。按照BCA试剂盒说明书配工作液和标准品①～⑧，分别取①～⑧标准品25 μL与200 μLWR混合，加入96孔板中，再取样品25 μL分别与200 μLWR混合，加入96孔板中，上述96孔板置于37 ℃反应30 min，在562 nm测定其吸光值。根据检测结果计算出样品的蛋白浓度，吸取100 μL含100～200 μg蛋白的样品，加入100∶1的2× Reaction Buffer和DTT混合液100 μL，再加入10 μL Caspase-3 Substrate 并于37 ℃避光孵育4 h，405 nm波长处测定其吸光值。

3实验结果

3.1DAPI染色后观察黄芪注射液对A-375细胞核的影响利用DAPI染色后，荧光显微镜观察结果如图1所示,对照组细胞核染色均匀一致，形状规则，细胞核膜光滑清晰。不同浓度的黄芪注射液处理的实验组可见细胞核的不同改变，其中100 mg/mL黄芪注射液处理72 h后可见核浓缩，染色较深，核膜不规则；300 mg/mL黄芪注射液处理48 h和200 mg/mL黄芪注射液处理72 h后均可发现除核浓缩，染色较深，荧光增强，有些核碎裂成大小不等的碎片，形成凋亡小体(如图1箭头所示)；300 mg/mL黄芪注射液处理72 h后，所有细胞核都碎裂成大小不等的碎片，即形成典型的凋亡小体，细胞质明显浓缩，细胞变小，无典型的细胞形态。随着黄芪注射液处理的浓度和时间的增加，核浓缩程度增加，细胞凋亡程度加大。

注：箭头所指为荧光小体 　　图1　黄芪注射液不同时间浓度对A375细胞凋亡的影响(DAPI染色×400)

3.2流式细胞术检测黄芪注射液对A-375细胞凋亡的影响利用200，300，400 mg/mL黄芪注射液处理48 h后，流式细胞术分析A-375细胞凋亡率，结果如图2所示，自200 mg/mL黄芪注射液实验组开始，在细胞周期图G0期出现亚二倍峰，即图2中箭头所指的区域,且随着黄芪注射液的浓度增加亚二倍峰值增加。同时，发现细胞的凋亡率随黄芪注射液浓度升高而增大，对照组及实验组(200，300，400 mg/mL黄芪注射液处理)的A-375细胞凋亡率分别为0.08%，1.10%，2.04%，14.06%。

3.3黄芪注射液对A-375细胞中Caspase-3活化的调节用100，200，300，400 mg/mL黄芪注射液处理A-375细胞24 h后，经过蛋白定量，在相同蛋白浓度下进行Caspase-3活性测定，结果如图3所示，终浓度为100，200 mg/mL黄芪注射液处理的实验组的OD值和对照组无明显差异，提示这两组浓度不能使Caspase-3活化；利用300,400 mg/mL黄芪注射液处理的实验组的Caspase-3活化程度明显降低。

图2　不同浓度黄芪注射液处理A-375细胞48 h后流式细胞仪分析结果

图3　黄芪注射液对A-375细胞caspase-3活性的影响

4讨论

恶性黑色素瘤是一类起源于神经嵴的黑色素细胞恶性肿瘤。其发病率为全身恶性肿瘤的1%～2%[5]，其恶性程度高，预后差[6]。近10年来，黑色素瘤发病率持续上升，应引起足够的重视[7]。

临床上多用黄芪配伍其他中药来改善癌症中、晚期患者的生活质量[8-9]。同时黄芪对多种肿瘤细胞也具有抑制作用[10-11]。黄芪还对化疗有着增效减毒的作用[12-14]。本实验利用DAPI荧光染色后，观察A-375细胞及细胞核的形态，结果显示，经过黄芪注射液处理过的细胞出现了明显的凋亡小体[7,15]；流式细胞分析结果表明，随着药物浓度的升高，A-375细胞的凋亡率随之升高，且呈时效-量效关系，这和DAPI荧光染色的结果一致。本实验证明黄芪注射液可以诱导A-375细胞凋亡，抑制黑色素瘤细胞的增殖。但值得探讨的是，Caspases-3是近年来发现的一组存在于胞质溶胶中的结构上相关的半胱氨酸蛋白酶，它们的一个重要共同点是其活化后可以特异地断开靶蛋白的天冬氨酸残基后的肽键，促使细胞凋亡[16]。虽然导致细胞凋亡最主要的途径之一即是Caspase依赖的信号通路，但目前发现凋亡诱导因子(Apoptosis-inducing factor，AIF)能够转位到细胞核，切断染色体DNA，从而通过Caspase非依赖的信号途径诱导凋亡[17]。而我们实验过程中发现黄芪注射液并不增加Caspases-3的活性，而且高浓度的黄芪注射液还降低了Caspase-3的活性；而DAPi染色荧光显微镜及细胞周期检测结果都证明黄芪注射液可以有效地促进人恶性黑色素瘤A-375细胞的凋亡。基于此，我们分析黄芪注射液诱导A-375细胞凋亡是通过不依赖caspase-3活性的途径起作用的，其具体作用机制还需要进一步研究。

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