大豆蛋白类抗营养因子对肠道健康的影响与新型蛋白酶的解决方案

■乔 伟

（北京盛拓达生物技术有限公司，北京100081）

大豆是一种优秀的植物蛋白源，蛋白质含量高，且氨基酸平衡性好，是性价比高的优质动物饲料原料，在鱼粉价格高涨的今天，更是一种优质原料。然而，大豆本身所含有多种抗营养因子，影响机体对养分的吸收利用与肠道健康。大豆中主要的抗营养因子为大豆抗原蛋白、大豆凝集素和胰蛋白酶抑制因子，它们都是大豆蛋白组成的重要成分，本文主要阐述大豆三大抗营养因子对肠道健康的影响与新型蛋白酶解决方案，为大豆蛋白在实际生产中的应用提供参考。

1 大豆蛋白类三大抗营养因子

1.1 大豆抗原蛋白

大豆中的抗原蛋白又称致敏蛋白，主要包括大豆球蛋白（glycinin）和三种伴大豆球蛋白（如：α-conglycinin、β-conglycinin和γ-conglycinin），这四种大豆球蛋白均能引起断奶仔猪过敏反应，其中glycinin和βconglycinin是大豆中免疫原性最强的两种抗原蛋白。大豆球蛋白是六聚体复合物，相对分子质量介于300～380 kDa之间。在大豆蛋白质中，大豆球蛋白含量最高，是大豆中的主要贮藏蛋白，也是最大的单体成分，占大豆籽实的25%～35%，是一种聚合蛋白质，含糖蛋白较少，具有良好的热稳定性。

β-伴大豆球蛋白是三聚体，相对分子质量150～200 kDa，占大豆总量的10%～12.7%，大豆蛋白质含量的30%，其含量仅次于大豆球蛋白，是导致大豆过敏的另一种主要抗原蛋白。β-伴大豆球蛋白同大豆球蛋白一样也具有良好的干热稳定性，100℃条件干炒对其抗原活性几乎没有影响。孙泽威等（2006）研究表明，120℃、7.5 min蒸汽热处理大豆，能使大豆球蛋白失去免疫活性，但对β-伴大豆球蛋白的活性来说基本不能失活。而在湿热处理过程中，70～80℃为β-伴大豆球蛋白的变性温度，温度升高至80℃左右时，蛋白质的二级结构发生最大程度的变化，β-伴大豆球蛋白的刚性结构发生部分解离，变为无规则的柔性结构；到达100℃时，亚基结构基本破坏。体外酶解试验表明，β-伴大豆球蛋白酶解产物中分子量为10～20 kDa的这部分肽段对胃蛋白酶和胰蛋白酶具有一定抵抗力。

大豆球蛋白分子结构紧密，大量酶切位点藏于蛋白质分子内部，很难被蛋白酶水解。因此，大豆球蛋白即有热稳定性也有不被内源蛋白酶降解的特性。大豆抗营养作用的30%由大豆球蛋白引起。

1.2 胰蛋白酶抑制因子

生大豆抗营养作用的40%是由胰蛋白酶抑制因子（trypsin inhibitors，TI）引起的，按照结构分胰蛋白酶抑制因子大约有7种，但目前只有库尼兹大豆胰蛋白酶抑制因子（Kunitz trypsin inhibitor，KTI）和包曼-伯克蛋白酶抑制因子（Bowman-Birk proteinase inhibitor，BBI）得到较广泛的关注和详细研究。生大豆中含有1.4%的KTI和0.6%的BBI（李德发，2003）。其中KTI含有181个氨基酸残基，含2个二硫键，1个活性中心，不溶于乙醇，易被酸和蛋白酶失活，由于分子内的二硫键含量少，所以对热也比较敏感，一般80℃短时间加热即可使其变性，而在90℃时就发生不可逆失活，可以与胰蛋白酶1∶1进行结合。BBI含71个氨基酸残基，7个二硫键，有2个活性中心，BBI不溶于丙酮，对热、酸的热稳定性好，即使在105℃干热10 min仍可以保持活性，且可以与胰蛋白酶1∶2进行结合，或者同时结合一个胰蛋白酶和一个胰凝乳蛋白酶。

1.3 大豆凝集素

大豆凝集素(SBA)主要存在于大豆子叶细胞中，约为大豆蛋白质总量的10%，是具有特异性结合能力的糖蛋白，蛋白质稳定性非常高，具有凝集动物红细胞、T淋巴细胞、促进淋巴细胞转化等生物活性，是大豆中含量较高的生物活性蛋白质。大豆抗营养作用的20%由SBA引起。它通过与动物小肠上皮细胞结合，进而破坏小肠正常结构来发挥其抗营养作用，影响体内营养物质吸收利用、抑制动物生长、引发腹泻等病理变化。

大豆凝集素具有很强的抗热变性能力，很多传统的热处理方法都不能使它有效失活。研究表明，即使经过140℃、15 min的干热处理，其活性下降的程度也较小。大豆凝集素经湿热处理后，80℃时其活性没有发生明显的变化，从95℃、25 min开始活性明显丧失，在95℃、35 min或120℃、15 min其活性完全丧失，这是因为凝集素是一种糖蛋白，有不可逆热变性的转折点，所以湿热处理可以作为消除凝集素抗营养作用的有效方法。

2 大豆三大抗营养因子对肠道健康的影响

2.1 大豆抗原蛋白对肠道健康的影响

大豆球蛋白在肠道内的分布受其浓度、抗原活性、动物健康等多方面因素的影响。在健康仔猪肠道中，大豆球蛋白含量呈先降后升的U字型变化趋势；从十二指肠到空肠中部显著下降，而在空肠后部到回肠呈现上升趋势，其中回肠的含量最高，而空肠中部的含量最低。在小肠绒毛内的大豆球蛋白浓度均极显著高于隐窝和集合淋巴小结。

大豆球蛋白对仔猪肠道健康的影响与其肠上皮细胞通透性有关。使用大豆球蛋白对体外培养的仔猪小肠上皮细胞进行刺激，结果表明大豆球蛋白能使仔猪小肠上皮细胞通透性增加。在一定剂量范围内，细胞培养液中乳酸脱氢酶(LDH)活性与大豆球蛋白浓度呈依赖式升高，而细胞跨膜电阻值(TEER)则下降；高浓度大豆球蛋白可使仔猪小肠上皮细胞紧密连接蛋白mRNA相对表达量降低。在水产动物研究中也发现，饲粮添加一定量大豆球蛋白使不同食性鱼类肠道组织结构完整性出现了不同程度的损伤，在鲤鱼的前肠、后肠及草鱼前肠和埃及胡子鲇后肠的小肠绒毛均有不同程度破损，固有层组织疏松而且断裂。

β-伴大豆球蛋白具有内在的免疫刺激能力，并能诱发过敏反应。β-伴大豆球蛋白可以通过诱导肠道氧化反应影响肠道结构及细胞通透性等，造成肠道损伤，并由此引发生长不良、消化和吸收功能障碍，影响动物肠道健康和正常生长。Chen等(2011)给10日龄仔猪饲喂β-伴大豆球蛋白并结合仔猪小肠上皮细胞体外培养试验，通过分析指出，β-伴大豆球蛋白刺激能增加肠细胞应激和炎症蛋白质的表达，通过抑制肠细胞的生长，破坏细胞骨架，并导致细胞凋亡引起仔猪小肠肠道损伤。这在体外培养的仔猪小肠上皮细胞通透性研究中也得到了验证。Zhao等(2014)用不同浓度的β-伴大豆球蛋白对仔猪小肠上皮细胞刺激测定其对上皮通透性、完整性、代谢活性、紧密连接分布和表达等的影响，结果表明，显著减少反式上皮电阻(TEER)、代谢活性和碱性磷酸酶(ALP)活性，且呈剂量依赖性方式显著增加；降低紧密连接mRNA的表达，免疫荧光标记细胞面积减小。对鱼的研究也表明，β-伴大豆球蛋白降低建鲤饲料转化率及体内胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、脂肪酶、肌酸激酶、钠离子、K+-ATP酶、碱性磷酸酶的活性，β-伴大豆球蛋白减少肠细胞中谷胱甘肽(GSH)及抗氧化酶的含量，诱导炎症和氧化，降低建鲤胰腺和肠道重量，减少肠道长度，从而导致肠道消化吸收的功能障碍。研究表明，β-伴大豆球蛋白提取物可以破坏鲤鱼肠上皮细胞结构的完整性，一定剂量β-伴大豆球蛋白能够破坏鲤鱼肠上皮细胞膜和线粒体膜，降低鲤鱼肠上皮细胞蛋白质沉积，抑制鲤鱼肠上皮细胞增殖。

2.2 胰蛋白酶抑制因子对肠道健康的影响

大豆胰蛋白酶抑制因子的抗营养作用主要表现在降低蛋白质消化率、引起胰腺增生和胰腺肿大、加剧氨基酸的不平衡、抑制动物生长等方面。

首先，胰蛋白酶抑制剂可与小肠液中胰蛋白酶特异性地结合生成无活性的复合物，降低胰蛋白酶的活性，导致蛋白质消化率和利用率降低；肠道内胰蛋白酶活性低时，引起胰腺机能亢进，分泌更多的胰蛋白酶，补充至肠道中，这会导致胰腺增生和胰腺肿大。

其次，引起动物体蛋白质内源性消耗，加剧氨基酸，尤其是含硫氨基酸的不平衡性。胰蛋白酶中含硫氨基酸丰富，胰蛋白酶大量补偿性分泌会造成体内含硫氨基酸内源性的消失，而大豆中含硫氨基酸的含量并不高，这会加剧体内氨基酸代谢不平衡，导致生长受阻或停滞。胰蛋白酶抑制剂引起含硫氨基酸内源性丢失是受到小肠黏膜分泌的一种激素——肠促胰酶肽(Cholecystokinin-Pancreozymin，CCK-PZ)调控的，肠促胰酶肽刺激胰腺腺体细胞分泌蛋白水解酶原(如胰蛋白酶原、糜蛋白酶原等)，肠促胰酶肽的分泌和小肠食糜中胰蛋白酶的含量呈负相关，即食糜中胰蛋白酶由于和胰蛋白酶抑制剂结合而减少时，肠促胰酶肽就分泌更多，因而刺激胰腺分泌更多的胰蛋白酶原至肠道中。这种机制称为胰腺分泌受肠道中胰蛋白酶数量的负反馈调节机制。除胰腺增生性变化而增重外，还可引起胰腺细胞的变性。表现为腺细胞体积增大或数量增多，胞质为酶原颗粒所充满，也会有细胞的变性，即胞质内细胞器排列不规则，酶原颗粒减少，粗面内质网小囊扩张、破碎并浮于细胞结构的半透明质内。

2.3 大豆凝集素对肠道健康的影响

大豆凝集素对动物生长有抑制作用，并随动物种类、生理阶段和饲喂量等而变化；影响动物对营养物质的消化吸收，其中对氮代谢的影响明显，尿氮损失随着日粮凝集素水平的提高而明显增加；同时对小肠结构和功能有不良影响。

SBA可特异性结合动物的上皮细胞，SBA作为一类糖蛋白化合物对N-乙酰基半乳糖胺和半乳糖有特异性的识别作用。猪的下颌黏蛋白也可以与SBA结合，因为其中含有Q-半乳糖胺在动物肠上皮细胞表面，特别是肠微绒毛顶端的细胞表面恰好存在着N-乙酰基半乳糖胺，SBA能特异性与小肠上皮细胞结合，不同种属动物肠壁对SBA的集合能力有所差异，但在小肠中总体来说呈降低趋势。其中十二指肠浓度最高，而回肠浓度最低。采用生物素标记技术及免疫组化技术研究不同动物肠上皮SBA结合位点的分布规律，发现在猪小肠内SBA结合主要在绒毛边缘及皱襞处的淋巴组织，隐窝内也有少量分布；在小肠各段中也多有结合，但在空肠前段最强；SBA在兔空肠各段有较多结合位点分布，空肠是SBA最敏感部位，主要集中于小肠绒毛柱状上皮细胞游离面；在鸡小肠各段均有SBA结合位点分布，主要在上皮细胞和杯状细胞，在空肠前段到后段，杯状细胞受体含量逐渐增加。

一定剂量的SBA与小肠上皮细胞的结合会引起动物肠道结构的损伤，改变其结构。断奶仔猪饲喂高浓度SBA可以增加肠道通透性，减少仔猪肠上皮紧密连接蛋白的表达。Li(2013)从细胞分子层面证明了大豆凝集素对仔猪小肠上皮细胞机械屏障功能和紧密连接蛋白表达的影响，结果表明凝集素处理增加体外培养的仔猪小肠上皮细胞膜的通透性，抑制细胞活力，降低紧密连接蛋白的表达水平，导致小肠上皮细胞机械屏障功能下降。

3 新型蛋白酶解决方案

早期对于大豆中的抗营养因子的处理方法，多为化学法，如热乙醇提取等，但该类方法所耗人力、物力太大，对环境污染大，化学试剂残留、影响适口性，且会造成一定的养分损失，因此只限于科研。20世纪90年代后用热处理如膨化等的方式较多，但只对热敏性的抗营养因子如胰蛋白酶抑制因子等有作用，且高温处理对大豆中的营养成分如维生素等损失较大，却对热稳定的大豆抗原蛋白作用不明显。近年来，用生物发酵的方式较多，降解抗原的效果也较好，但存在设备投入大、生产周期长、菌种变化大、产品品质不稳定等多种因素，而且发酵过程会使大豆中的能量大量因微生物发酵生长而消耗，降低大豆类产品的能量价值。超级蛋白酶SP100（北京盛拓达生物技术有限公司生产）是一种新型蛋白酶，是具有良好的热稳定性、pH值广谱性、原料底物广谱性，可以降解羽毛粉、醇溶蛋白，也对大豆中的三大抗营养因子有较好的降解作用。

3.1 蛋白酶对大豆抗原蛋白的降解

针对大豆中的三大抗营养因子，我们提出了完全不同于以往的研究，采用新型耐高温蛋白酶SP100进行处理的方式，可以有效降解大豆抗原蛋白，降解率可达90%左右，而且不会对大豆中的营养成分有损害。该方式简单易行，用于饲料中，也可以用于发酵豆粕的发酵过程中。蛋白酶SP100对生大豆、豆粕、纯抗原蛋白这三种形态存在的大豆蛋白和β-伴大豆球蛋白的降解效果如表1所示。因此可见，蛋白酶SP100在体外对大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白的降解率分别达94%和88%，如果在体内，结合其内源他酶的作用，降解率会更高。

表1 蛋白酶SP100对大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白的降解效果

3.2 蛋白酶对胰蛋白酶抑制因子和大豆凝集素的降解

将大豆凝集素和胰蛋白酶因子用蛋白酶水解后再电泳分析进行研究，结果表明，蛋白酶SP100对大豆凝集素、胰蛋白酶抑制因子KTI和BBI都有良好降解效果。

3.3 蛋白酶对机体肠道健康的影响

Wang等（2008）在肉鸡中的研究报道，在日粮中添加蛋白酶可改善肉鸡的肠道形态，增加小肠绒毛高度，降低隐窝深度。

Wang(2011)用蛋白酶在断奶仔猪上的研究结果表明，添加蛋白酶显著降低回肠、盲肠和结肠中食糜氨态氮的含量（P＜0.05），降低盲肠和结肠中大肠杆菌的数量（P＜0.05），增加了乳酸杆菌的数量（P＜0.05），并降低断奶仔猪结肠中总耗氧菌的数量（P＜0.05），增加总厌氧菌的数量（P＜0.05）。对断奶仔猪肠道形态影响的结果表明，蛋白酶可以显著提高断奶仔猪回肠绒毛高度与隐窝深度的比值（P＜0.05），降低空肠和回肠的隐窝深度（P＜0.05），从而表明蛋白酶可以改善肠道结构健康，并促进肠道有益菌群的繁殖，有利菌群平衡。

4 小结

大豆作为一种良好的植物蛋白源在饲料中具有重要的营养地位，然而抗营养因子严重影响了动物肠道健康，刺激肠道产生不良反应，破坏肠道的正常结构，影响动物肠道的消化、吸收、屏障和免疫功能。盛拓达公司新研发的蛋白酶SP100，可以有效的降解大豆中的三大抗营养因子，减少它们对肠道健康的不良影响，促进肠道有益微生物的繁殖，改善肠道结构和健康。