响应面法优化超声波辅助提取河阴石榴多糖工艺研究

闫生辉+李兴奎+高玉红

摘要：为了优化河阴石榴（Punica granatum L.）多糖的超声波提取工艺，研究了超声波提取时的提取温度、液料比、超声功率和超声时间单因素条件对河阴石榴多糖提取效果的影响，在此基础上，根据Box-Benhnken中心组合试验设计原理，采用三因素三水平响应面分析法建立二次回归模型，同时对各因素和因素交互作用进行方差分析，从而确定河阴石榴多糖超声提取的最佳工艺条件为提取温度48.5 ℃，提取时间36 min，超声波功率390 W。在此条件下，石榴多糖提取率的预期值为15.95%，试验验证值为15.68%。将优化后的试验条件与传统的水提法相比，不但提高了石榴多糖提取的效率，而且多糖得率提高了5.79个百分点。

关键词：河阴石榴（Punica granatum L.）;多糖;超声波提取;响应面分析

中图分类号：S665.4         文献标识码：A         文章编号：0439-8114（2015）23-5987-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.23.049

Optimization of Polysaccharides from Heyin Pomegranate Using Response Surface Methodology and Ultrasonic Extraction

YAN Sheng-hui，LI Xing-kui，GAO Yu-hong

（Zhengzhou Vocational Technology College， Zhengzhou 450121， China）

Abstract： In order to optimize ultrasonic extraction of polysaccharides in Heyin Pomegranate（Punica granatum L.），effects of extraction temperature，ratio of water to material，extraction rate and extraction time were investigated respectively in single-factor tests. Based on the principle of Box-Behnken design， response surface methodology with three factors and three levels were applied，and then interactive effects of the independent variables on extraction were established. The result showed that the optimum extraction temperature，time，and rate for polysaccharides extraction from Heyin Pomegranate are 48.5 ℃，36 min，390 W，respectively. Under the above conditions，the actual extraction rate reached up to 15.68%， which was close to the predicted value of 15.95%.Compared with the traditional water extraction method，the efficiency of optimization of polysaccharides from Heyin Pomegranate was greatly improved，and the extraction yield of polysaccharide was increased by 5.79 percentage points.

Key words： Heyin Pomegranate（Punica granatum L.）; polysaccharides; ultrasonic extraction; response surface methodology

石榴（Punica granatum L.）是落叶乔木或灌木，属于石榴科（Punicaceae）石榴属（Punica L.）植物，原产巴尔干半岛至伊朗及其邻近地区，现主要分布在亚洲、非洲、欧洲沿地中海等温带和热带地区[1]。石榴在中国南北各地均有种植，主要分布在陕西、安徽、山东、江苏、河南、四川、云南及新疆等地。目前，有玛瑙石榴、粉皮石榴、青皮石榴、玉石子等70多个种类，其中河南省荥阳市的河阴石榴因其果实色泽鲜艳，石榴皮薄光滑，特别是石榴仁特软可食，其味甘甜而无渣滓，结束了吃石榴吐子的历史，因此河阴石榴畅销全国，为河南特产之一。近年来，各国科研工作者陆续发现石榴中含有丰富的蛋白质、氨基酸、微量元素、类固醇、激素、生物碱和多糖等活性物质[2-5]，因此被广泛应用于医药和保健领域。

多糖广泛分布于自然界的多种生物体中，尤其是动物细胞膜、植物细胞壁和微生物细胞壁中，是一类由醛糖或酮糖通过糖苷键连接而成的天然高分子多聚物，是构成生命体的分子基础之一。多糖具有多种药理活性，它不仅可以作为广谱免疫促进剂调节机体免疫功能，还在抗肿瘤、抗病毒、抗氧化、降血糖、抗辐射等方面发挥广泛的药理作用。迄今为止，已有300多种多糖类化合物从天然产物中分离出来，其中从植物中提取的水溶性多糖最为重要。因为其药理活性强，来源广泛，细胞毒性低，安全性强，毒副作用较小，已引起医药界的广泛关注，并成为当今生命科学研究的热点之一[6-10]。endprint

超声波辅助提取法是一种从植物中提取有效成分的重要方法，依靠的是超声波的空化效应、热效应和机械作用[11-14]，近年来被广泛用于植物有效成分的提取研究。目前，关于河阴石榴超声波多糖提取的工艺鲜有研究报道，本试验将超声波技术应用于河阴石榴的多糖提取工艺，并运用响应面法进行优化，从而得到最佳的提取工艺条件，为河阴石榴多糖的制备提供参考。

1  材料与方法

1.1  材料与仪器

荥阳市广武乡阵沟河阴石榴生产基地采集新鲜石榴，选取样品以色泽鲜艳、外表光滑、大小适中为标准，室内常温贮藏15 d。葡萄糖、无水乙醇、浓硫酸、苯酚等试剂均为分析纯。

主要仪器和设备：组织捣碎机（DFT-250型），上海麦尚科学仪器有限公司;电热恒温干燥箱（WHL-25A型），河南省泰斯特仪器有限公司;紫外可见分光光度计（UV-1800型），日本岛津公司;超声波提取机（KB-50型），北京林子大科技有限公司;台式低速离心机（80-2型），上海医疗机械有限公司;电子天平（WA），上海方瑞仪器有限公司。

1.2  河阴石榴中多糖的测定

河阴石榴中多糖的测定采用苯酚-硫酸法[15]。准确称取标准葡萄糖20 mg于500 mL容量瓶中，加水至刻度，分别吸取0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mL，各以去离子水补至2.0 mL，然后加入6%苯酚1.0 mL及浓硫酸5.0 mL，摇匀冷却，室温放置20 min以后于490 nm测定吸光度，以2.0 mL水按同样显色操作为空白，以多糖质量为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。

取样品1 g加1 mL 15%三氯乙酸溶液进行反复研磨，将清液和残渣一起到入10 mL的离心管中进行离心。取上清液到25 mL锥形比色管中，加入2 mL 6 mol/L盐酸之后摇匀，最后滤液保持18 mL左右，在96 ℃水浴锅中水浴2 h。冷却后加入2 mL 6 mol/L 氢氧化钠定容至25 mL的容量瓶中。吸取0.2 mL的样品溶液，以去离子水补至2.0 mL，然后加入6%苯酚1.0 mL及浓硫酸5.0 mL，摇匀冷却至室温时进行测定。

根据试验结果得到多糖浓度后计算多糖提取率：

多糖提取率=多糖质量/原料质量×100%

1.3  单因素试验

1）提取温度对河阴石榴多糖提取率的影响。分别取2.000 g预处理好的样品5份，加入40 mL的去离子水后分别置于30、40、50、60、70 ℃的水浴中进行充分的溶解。在400 W的超声波功率下提取35 min，测定不同提取温度下河阴石榴多糖的提取率。

2）提取时间对河阴石榴多糖提取率的影响。分别取2.000 g预处理好的样品5份，分别加入40 mL的去离子水后置于50 ℃的水浴中进行充分溶解。在400 W的超声波功率下分别提取25、30、35、40、45 min，测定不同提取时间下河阴石榴多糖的提取率。

3）超声波功率对河阴石榴多糖提取率的影响。分别取2.000 g预处理好的样品5份，加入40 mL的去离子水后置于50 ℃的水浴中进行充分的溶解。分别在200、300、400、500、600 W的超声波功率下提取35 min，测定不同超声波功率下河阴石榴多糖的提取率。

4）液料比对河阴石榴多糖提取率的影响。分别取2.000 g预处理好的样品5份，分别加入20、30、40、50、60 mL的去离子水后分别置于50 ℃的水浴中进行充分溶解。在400 W的超声波功率下提取35 min，测定不同液料比下河阴石榴多糖的提取率。

1.4  响应面试验

采用单因素试验研究了提取时温度、液料比、超声功率和超声时间对提取河阴石榴多糖的影响，从而确定提取温度（X1）、提取时间（X2）和超声波功率（X3）作为主要自变量，采用响应面法对河阴石榴多糖的提取工艺进行优化，采用Box-Behnken Design（BBD）进行试验设计，通过拟合二次多项式方程，计算出最优工艺组合以及在此条件下河阴石榴多糖提取率的最大理论值[16-20]。以+1、0、-1分别代表自变量的高中低水平，以河阴石榴多糖提取率为目标，通过响应曲面分析对提取条件进行优化。响应曲面因素和水平如表1所示。

1.5  验证与比较试验

按照计算分析得到的最佳工艺条件进行提取试验操作，从而验证预测结果的准确性。并将试验结果与传统的水提法提取多糖的提取率进行结果比较[21]，证明优化后超声波提取工艺的优越性。

2  结果与分析

2.1  单因素试验结果

2.1.1  提取温度对河阴石榴多糖提取率的影响  由图1可知，在一定的条件下随着提取温度的升高，河阴石榴多糖的提取率逐渐增大，在50 ℃时，提取率达到最大，温度继续升高，对提取率影响不大。可能是在此条件下多糖分子已经具有了从样品中脱离的动能，继续升高温度对提取率没有明显的影响。因此，最佳的提取温度确定为50 ℃。

2.1.2  提取时间对河阴石榴多糖提取率的影响  由图2可知，在一定的条件下，随着提取时间的延长，河阴石榴多糖提取率逐渐上升，35 min时达到了峰值，继续延长时间，提取率反而减小。可能是延长时间有利于细胞内有效成分的释放，然而过长时间导致了多糖在酸性条件下发生了水解，从而降低了提取效率。因此，最佳的超声提取时间确定为35 min。

2.1.3  超声波功率对河阴石榴多糖提取率的影响  由图3可知，随着超声波功率的增大，河阴石榴多糖提取率呈先上升后下降的趋势，在功率为400 W时提取率最高，可能是当超声波的功率为400 W左右时，多糖分子具有的动能能够使其最大限度地从样品中释放出来。然而随着超声波功率的继续增大，可能使多糖分子具有了更大的能量，反而促使了多糖分子的降解，从而导致了提取率的降低。因此，最佳提取率确定为400 W。endprint

2.1.4  液料比对河阴石榴多糖提取率的影响  由图4可知，在一定的条件下，随着液料比的增大，多糖提取率逐渐上升，当液料比大于20∶1时对多糖提取率几乎没有影响，因此在进一步条件优化时，选择液料比为20∶1的固定值。

2.2  响应面试验结果

2.2.1  响应面试验结果及方差分析  根据单因素试验结果，结合RSM的中心组合试验设计原理，取2.000 g预处理好的样品17份，择优选取提取温度（X1）、提取时间（X2）和超声波功率（X3）3个对多糖提取率相对重要的因素，采用三因素三水平的响应面分析方法分析优化工艺参数。响应面分析试验结果见表2和表3。

从响应面方差分析表3可知，由试验结果得到的模型F为17.34，P为0.000 5，表明该模型显著。由模型拟合得到的回归方程为R1=15.69-0.27X1+0.28X2+0.93X3-（7.5E-3）X1X2+0.13X1X2-0.28X2X3-0.28X12-0.80X22-X32，其方程的R2为0.957 1。方程中P值小于0.05的项代表显著项，包括X1提取温度，X2提取时间，X3超声波功率及其二次项X22、X32。由拟合得到的回归方程可知，各影响因素与响应值的关系并不是简单的线性关系，方程的失拟度值为0.43，表示该回归方程相对于绝对误差而言失拟度并不显著，能够较准确地反映各影响因素与其响应值之间的关系，多糖的最佳提取工艺条件可以由此方程确定，得到最优提取工艺为河阴石榴多糖提取率最大预测值15.95%相对应的提取工艺条件为：提取温度48.5 ℃，提取时间36.2 min，超声波功率396.5 W。

2.2.2  试验因素交互作用对响应值影响的3D分析  提取时间和提取温度交互作用对响应值影响的3D分析如图5所示。由图5可知，提取时间和提取温度对河阴石榴多糖的提取率影响不大。当温度过高时多糖的提取率减少，可能是因为高温导致多糖的分子结构发生了变化，从而影响了多糖的提取率。

提取时超声波功率和提取温度交互作用对响应值影响的3D分析如图6所示。由图6可知，当超声波功率和提取温度过高时，导致多糖提取率明显下降，可能是因为在高温时，过高的超声波功率更容易破坏多糖分子的结构，从而导致多糖提取率的下降。

提取时超声波功率和提取时间交互作用对响应值影响的3D分析如图7所示。由图7可知，当超声波功率和提取时间超过一定值时，在过长的时间里高强度的超声功率严重破环了多糖的组织结构，从而降低了多糖的提取率。

由以上分析可知，超声波功率和提取温度对响应值的影响较大，其交互项对试验结果的影响也较大，而提取时间对试验结果的影响较小，这和响应曲面的方差分析结果一致，这表明由各个试验因素与响应值的关系模拟与试验所得的数据较为吻合，因此可以用此模型得到多糖的最佳提取工艺条件。

2.3  最优提取工艺的验证

根据以上分析并结合实际试验操作条件，将河阴石榴多糖提取工艺条件修正为提取温度48.5 ℃，提取时间36 min，超声波功率390 W。河阴石榴多糖提取率为15.68%，接近预测值15.95%，结果较为理想。试验采用传统的水提法得到河阴石榴的多糖提取率为9.89%，相比于传统的提取方法使多糖提取率提高了5.79个百分点。

3  小结

本试验采用响应面法优化了超声波辅助提取河阴石榴多糖的工艺，得到的最佳提取工艺条件为提取温度48.5 ℃，提取时间36 min，超声波功率390 W。在此条件下，河阴石榴多糖提取率的预期值为15.95%，试验验证值为15.68%。将优化后的试验条件与传统的水提法相比，不但提高了河阴石榴多糖提取的效率，而且多糖得率提高了5.79个百分点。

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