侵染油茶的两种病原菌的鉴定及其生物学特性研究

史红安+傅本重+张志林+李国元+王立华

摘要：为了掌握湖北孝感本地油茶（Camellia oleifera）主要病害发生规律，采用常规组织分离法分离病原菌，依据病原菌的形态特征，结合其rDNA-ITS序列分析，对油茶病原菌进行分离和分子鉴定，并对其生物学特性进行了研究。结果表明，鉴定两种病原菌分别为胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）和链格孢（Alternaria  alternata）;炭疽病菌菌株在PDA培养基中生长最快，最适碳源和氮源分别为淀粉、硫酸铵，pH 6.0为宜，最适生长温度为25 ℃，致死温度为52 ℃;链格孢菌株最适培养基为PDA培养基，以淀粉为碳源、硝酸铵为氮源为宜，pH 8.0时菌丝生长最快，最适温度为25 ℃，致死温度为54 ℃。

关键词：油茶（Camellia oleifera）;病原菌;胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）;链格孢（Alternaria alternata）;生物学特性

中图分类号：S432.4+4        文献标识码：A        文章编号：0439-8114（2015）23-5908-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.23.028

The Study of Two Camellia Pathogens Isolation，

Identification and Biological Characteristics

SHI Hong-an1，2，FU Ben-zhong1，ZHANG Zhi-lin1，LI Guo-yuan1，WANG Li-hua1

（1.Hubei Key Laboratory of Quality Control of Characteristic Fruits and Vegetables，Hubei Engineering University， Xiaogan 432000，

Hubei， China;2. College of life science， Hubei University，Wuhan  430062，China）

Abstract： The two Camellia pathogens were isolated， identified， and the primary biological characteristics were determined. By using routine isolation method from tissue， following morphological characteristics， combining with the result of the rDNA-ITS sequence analysis， the two pathogens were identified as Colletotrichum gloeosporioides and Alternaria alternata，respectively.The test showed the pathogen C. gloeosporioides grew best in PDA media，starch as carbon source，ammonium sulfate as nitrogen source，pH 6.0， the optimum temperature was 25 ℃ and the lethal temperature was 52 ℃;For A. alternata，which grew best in CMM， starch as the carbon source，ammonium nitrate as nitrogen source，pH 8.0，the optimum temperature was 25 ℃， and the lethal temperature was 54 ℃.

Key words： Camellia oleifera; pathogen; Colletotrichum gloeosporioides; Alternaria  alternata; characteristics

油茶（Camellia oleifera）属山茶科（Theaceae）山茶属（Camellia），是中国特有的一种高级油料作物，主要生长于中国南方亚热带地区高山及丘陵地带，是重要的木本油料树种之一[1]。油茶炭疽病（Colletotrichum gloeosporioides Penz.）是油茶的主要病害之一，该病在中国各油茶产区普遍发生，油茶的地上各部位均可受害，主要引起落果、落蕾、枝梢枯死、枝干溃疡、甚至整株死亡[2]。病落果率通常在20%左右，有时高达40%以上。近年来，湖北油茶种植规模不断扩大，相应的病害逐步引起重视。尤其是苗圃的病害发生严重，苗木调运也能引起病害传播，因此，对苗圃的病原菌检测显得尤为重要。目前对油茶炭疽病的防治只有通过种植抗性品种和化学防治来控制。本试验对引起湖北孝感本地油茶炭疽病的病原菌进行了鉴定，并对病原菌的生物学特性进行初步研究，为防治该病害提供理论依据。

1  材料与方法

1.1  病原菌的分离、纯化及存种

于2013年10月从湖北省孝感市油茶苗木基地采集病株标本。油茶品种为长林2号。

采用常规组织分离法[3]分离病原菌，从病叶病健交界处切取长约3 cm的组织，用清水冲洗表面杂物，置于0.1%的酸性升汞水溶液中2 min，取出用去离子水冲洗2次，再用体积分数为70%乙醇处理30 s，去离子水冲洗3次，在无菌条件下接种至PDA培养基上，于28 ℃培养箱中恒温培养，待菌落长出后，移入另一平板培养。经过3次以上纯化，将所获菌株编号接种于试管斜面，待菌落长出后，于4 ℃保存。endprint

1.2  病原菌鉴定

1.2.1  病原菌形态学特征观察  将纯化后的菌种转接到PDA平板上，置于25 ℃条件下培养5 d，观察记载菌落形态、颜色、基质颜色及分生孢子形态特征，作为鉴定病原菌的主要形态学依据。参照魏景超[4]、陆家云[5]的方法进行病原菌鉴定。

1.2.2  病原菌rDNA-ITS的扩增与序列分析  病原菌DNA提取参考何月秋[6]的方法。选取无污染且生长良好的5～6 d菌3皿，用灭菌刀片刮取菌丝，称重后得到DNA，置于-20 ℃保存。

采用真菌的通用引物ITS4和ITS5进行PCR扩增，引物序列为5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′，5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAA-3′[7]。PCR反应总体系为50 μL，反应液为引物ITS4和ITS5（上海生工生物工程有限公司） 各0.5 μL、10×buffer 5 μL、dNTP 5 μL、Taq酶0.4 μL、MgCl2 5 μL、去离子水32.6 μL。 PCR扩增条件： 94 ℃预变性5 min，94 ℃变性50 s，50 ℃退火50 s，72 ℃延伸1 min，共35个循环;最后72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。扩增产物用1.5%的琼脂糖凝胶进行电泳，通过凝胶成像系统显示记录电泳结果。PCR产物委托上海生工生物工程有限公司进行纯化和测序。

1.3  病原菌生物学特性测定

1.3.1  培养基试验  马铃薯葡萄糖培养基（PDA）：马铃薯200 g、葡萄糖 20 g、琼脂粉20 g、去离子水1 000 mL。沙堡弱培养基（SDA）：葡萄糖40 g、蛋白胨10 g、琼脂粉20 g、去离子水1 000 mL。燕麦培养基（OA）：燕麦片30 g、琼脂粉20 g、去离子水1 000 mL。玉米粉培养基（CMM）：玉米粉40 g、蔗糖10 g、琼脂粉20 g、去离子水1 000 mL。查氏培养基（CZ）：蔗糖30 g、硝酸钠2 g、氯化钾0.50 g、硫酸亚铁0.010 g、磷酸二氢钾1 g、琼脂粉20 g、去离子水1 000 mL。取培养5 d的病原菌，用打孔器取直径6 mm的菌饼分别接种在5种培养基平板中央，每个处理重复3次，于28 ℃培养箱培养5 d后，用十字交叉法测量菌落直径。

1.3.2  碳源试验  以查氏培养基[8]为基础培养基，分别以葡萄糖、肌醇、D-果糖、乳糖、可溶性淀粉代替蔗糖，取培养5 d直径6 mm的菌饼分别接种在上述培养基平板中央，每个处理重复3次，于28 ℃培养箱培养5 d后，用十字交叉法测量菌落直径。

1.3.3  氮源试验  以查氏培养基为基础培养基，分别以硝酸钾、硝酸铵、硫酸铵、草酸铵、甘氨酸代替硝酸钠，取培养5 d的病原菌，用打孔器取直径6 mm菌饼分别接种在上述培养基平板中央，每个处理重复3次，于28 ℃培养箱培养5 d后，用十字交叉法测量菌落直径。

1.3.4  pH试验  以PDA培养基为基础培养基，用1 mol/L的HCl和1 mol/L的NaOH溶液调节pH为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0，共8个梯度，取培养5 d的病原菌，用打孔器取直径6 mm的菌饼接种在供试8个梯度平板中央，每个处理重复3次，于28 ℃培养箱培养5 d后，用十字交叉法测量菌落直径。

1.3.5  温度试验  以PDA培养基为基础培养基，取培养5 d的病原菌，用打孔器取直径6 mm菌饼分别接种在平板中央，分别置于5、10、15、20、25、30、35 ℃中培养，每个处理重复3次，培养5 d后用十字交叉法测量菌落直径。

1.3.6  致死温度试验  将直径6 mm的菌饼置于装有5 mL的去离子水中，将试管分别置于48、49、50、51、52、53、54、55 ℃的恒温水浴锅中处理10 min后迅速冷却，再将菌饼取出置于PDA培养基上，每个处理重复3次，于28 ℃培养箱培养5 d后，用十字交叉法测量菌落直径。

2  结果与分析

2.1  病原菌鉴定

2.1.1  病原菌分离与形态鉴定  从油茶病叶上分离得到20株菌株，所对应的编号为XCGO1-20，根据形态特征将菌株分为两类（XCGO1、2、3、5、13、14、15、16、20为一类，剩余的为一类），以XCGO1、XCGO4（图1-A、1-B）为代表。XCGO1呈圆形生长，初为白色，绒毛状，逐渐呈深褐色，分生孢子为棕红色，并且色素渗入培养基内，菌落终为棕红色。XCGO4呈同心轮纹生长，初为深绿色，菌落终为中央黑色，外部青褐色，边缘色浅。

2.1.2  显微状态特征  XCGO1显微结构观察结果（图1-C）表明，分生孢子单胞，无色光滑，棒状，两端圆钝，大小为（13.41～15.96） μm×（5.19～5.63） μm，平均15.32 μm×5.56 μm。XCGO4显微结构观察结果（图1-D）表明，分生孢子多数呈倒梨形或近卵状，偶见狭棒状或倒棒状，黄褐色至褐色，具横膈3～7个，纵斜膈膜0～4个，分生孢子大小为（24.4～48.9） μm×（7.3～12.2） μm，平均4.5 μm×9.2 μm。

2.1.3  病原菌rDNA-ITS的分析  XCGO1、XCGO4的PCR扩增产物，经测序分析确定片段全长分别为519 bp和506 bp。两个菌株rDNA-ITS基因系统发育结果显示，菌株XCGO1序列与GenBank 登录号JX010152（C. gloeosporioides）的同源性达到99%，确定为胶孢炭疽病菌（C. gloeosporioides）（图2）。菌株XCGO4序列与GenBank登录号KJ716876（Alternaria alternata）的同源性达到100%，确定为链格孢（A. alternata）（图3）。endprint

2.2  病原菌生物学特性测定

2.2.1  培养基对菌丝生长的影响  菌株XCGO1、XCGO4在以上5种培养基上均能生长，菌株XCGO1在PDA培养基上生长速率高于其他培养基，CMM培养基次之;菌株XCGO4在PDA培养基上生长速率显著高于其他培养基，CZ培养基上的生长速率最低（表1）。

2.2.2  碳源对菌丝生长的影响  在供试的5种碳源中，菌株XCGO1在以淀粉为碳源的培养基上生长最快，菌丝生长速率达到6.4 cm/d，显著高于其他供试碳源;菌株XCGO4在以淀粉为碳源的培养基上生长最快，菌丝生长速率达到7.5 cm/d（表2）。

2.2.3  氮源对菌丝生长的影响  在供试的5种氮源中，菌株XCGO1在以硫酸铵为氮源的培养基上生长最快，菌丝生长速率达到6.0 cm/d;菌株XCGO4 在以硝酸铵为氮源的培养基上生长最快，菌丝生长速率达到6.7 cm/d（表3）。

2.2.4  pH对菌丝生长的影响  如图4所示，在pH 4～11范围内，两种病原菌菌丝均能生长，菌株XCGO1在pH 6时最适生长，菌落直径达到6.40 cm，在pH 4时菌丝生长最弱，菌落直径只有5.28 cm。菌株XCGO4在pH 8时最适生长，菌落直径达到6.45 cm，在pH 4时菌丝生长最弱，菌落直径仅3.40 cm。

2.2.5  温度对菌丝生长的影响  图5表明，病原菌菌丝在20～30 ℃均能较好生长，菌落直径明显大于其他温度。其中25 ℃是两种菌株的最适生长温度，菌株XCGO1的菌丝生长速度较菌株XCGO4快。温度低于10 ℃或高于30 ℃时生长速度显著下降。

2.2.6  致死温度试验  致死温度试验结果表明，菌株XCGO1在52、53、54、55 ℃高温处理10 min后，没有菌丝生长，表明菌株XCGO1的致死温度为52 ℃，致死时间为10 min。菌株XCGO4在54、55 ℃高温处理10 min后，没有菌丝生长，表明菌株XCGO4的致死温度为54 ℃，致死时间为10 min。

3  小结与讨论

仅根据生物学形态特征对病原菌进行鉴定和分类是不够的，ITS序列在炭疽菌的鉴定中的应用为其鉴定提供了有力的依据。本研究综合病原菌的形态学特征、生物学特性以及rDNA-ITS序列分析结果，鉴定出引起油茶病害的病原菌为C. gloeosporioides和A. alternata。本研究中C. gloeosporioides的形态特征与叶航等[9]报道的油茶炭疽病病原菌特征相似。A. alternata与周求根等[10]研究的贡梨黑斑病病原菌形态特征相似。该病原菌自1933年在果树上报道以来，再次在油茶上发现并报道。通过对其生物学的研究发现，两种病原菌在供试的培养基中均能生长，不存在差异。炭疽病菌菌株以淀粉为最适碳源、硫酸铵为最适氮源、pH 6.0为宜，最适生长温度为25 ℃，致死温度为52 ℃;链格孢菌株以淀粉为最适碳源、硝酸铵为最适氮源，pH 8.0时菌丝生长最快，最适生长温度为25 ℃，致死温度为54 ℃。

中国拥有丰富的油茶种质资源，南方大部分地区都适宜生长。油茶不仅营养价值丰富，而且大力发展油茶是解决中国食用油安全问题的重要途径之一，但病害对油茶产量有很大的影响。叶航等[9]在田间观察发现，不同油茶物种、品种炭疽病的发病率不同，即使是同一品种，不同部位的发病率也不一样。分离于油茶叶片的油茶炭疽病原菌有利于病菌种群划分。本文通过对油茶病原菌的鉴定，以及病原菌的生物学特性研究，为油茶病害的综合治理提供理论基础。

参考文献：

[1] 庄瑞林.中国油茶[M].北京：中国林业出版社，2008.

[2] 束庆龙，张良富.中国油茶栽培与病虫害防治[M].北京：中国林业出版社，2009.

[3] 方中达.植病研究方法[M].第三版.北京：中国农业出版社，1998.

[4] 魏景超.真菌鉴定手册[M].上海：上海科技出版社，1979.

[5] 陆家云.植物病原真菌学[M].北京：中国农业出版社，2001.

[6] 何月秋.真菌菌丝体培养和提取DNA方法的改进[J].菌物系统，2000，19（3）：434.

[7] 张彩霞，陈  莹，李  壮，等.苹果斑点落叶病致病菌的鉴定及生物学特性研究[J].生物技术，2011，21（4）：58-61.

[8] 王  宏，常有宏，陈志谊.梨黑斑病病原菌生物学特性研究[J].果树学报，2006，23（2）：247-251.

[9] 叶  航，韦  维，吴  波，等.油茶炭疽病病原菌的分离和初步鉴定[J].江西农业大学学报，2014，36（2）：314-318.

[10] 周求根，李  诚，蒋军喜，等.贡梨果实黑斑病病原菌鉴定及室内防治药剂筛选[J].中国南方果树，2013，42（5）：35-38.endprint