CS-ISPH-TPP亚微米颗粒的粒径与表面电位影响因素研究

CS-ISPH-TPP亚微米颗粒的粒径与表面电位影响因素研究

娄本浊

(陕西理工学院 物理与电信工程学院， 陕西 汉中 723000)

[摘要]以带正电的几丁聚醣(CS)与带负电的三聚磷酸钠(TPP)通过离子交联作用包覆分离大豆蛋白质水解物(ISPH)制成CS-ISPH-TPP亚微米颗粒，利用动态光散射法分析ISPH浓度、CS分子量及CS/TPP质量比对亚微米颗粒的粒径与表面电位的影响。结果表明，CS-ISPH-TPP亚微米颗粒的粒径随ISPH添加浓度的增加而增大，而表面电位则无明显变化。CS-TPP与CS-ISPH-TPP亚微米颗粒的粒径会随CS分子量的增加而增大，且包覆ISPH颗粒的粒径均大于未包覆的颗粒，而表面电位则介于41.9~44.2 mV之间。CS/TPP质量比由6∶1减至4∶1时，颗粒粒径会随之增加，而由4∶1减至2∶1时，粒径则变小；CS/TPP质量比由6∶1减至3∶1时，颗粒表面均带有高度的正电荷，继续减至2∶1时，表面电位会出现骤降的情形。

[关键词]动态光散射； CS-ISPH-TPP；纳米颗粒；粒径； 表面电位

[文章编号]1673-2944(2015)05-0073-06

[中图分类号]O631.2; TQ645.9

收稿日期：2015-01-09

基金项目：国家自然科学基金资助项目(41105107)；陕西省自然科学基础研究计划项目(2012JM5014)

作者简介：娄本浊(1982—)，男，山东省济南市人，陕西理工学院讲师，硕士，主要研究方向为光学技术的开发与应用。

以几丁聚醣(chitosan，CS)作为基材制备亚微米颗粒已被广泛应用在药物传递中，CS可通过物理法与化学法将药物吸附于表面或包覆在微纳颗粒中。Ko等[1]利用CS与三聚磷酸钠(sodium tripolyphosphate，TPP)的离子交联作用制备500~710 nm的CS-TPP亚微米颗粒，并指出降低TPP溶液的pH值及增加CS分子量时可获得表面平滑的球状颗粒。Xu等[2]以CS-TPP包覆牛血清蛋白(bovine serum albumin，BSA)制备20~200 nm的亚微米颗粒，并指出所得颗粒的特性会受CS的浓度及BSA添加量的影响。Gan等[3]将CS-TPP亚微米颗粒应用于基因传递上可获得粒径介于100~250 nm且表面带高度正电荷的微纳颗粒，并指出CS/TPP质量比对亚微米颗粒的粒径与表面电位有很大影响；粒径与表面电位均随CS/TPP质量比增加而增大，而CS/TPP质量比固定时表面电位会随CS浓度增加而减小。Wu等[4]利用CS-TPP亚微米颗粒包覆甘草酸铵获得表面带正电荷的亚微米颗粒，利用动态光散射测得颗粒粒径大于120 nm。Grenha等[5]将CS亚微米颗粒应用于肺蛋白传递上，指出在水溶液中亚微米颗粒的粒径与表面电位不会改变。Gan等[6]以CS-TPP亚微米颗粒包覆BSA得到200~580 nm之间且表面带有高度正电荷的CS-BSA-TPP微纳颗粒。Jang等[7]探讨包覆VC的CS亚微米颗粒在水溶液中加热处理的安定性时指出，当CS与TPP浓度分别为1.5 mg/mL与0.6 mg/mL时可得粒径约为170 nm的颗粒；当VC浓度由0.1 mg/mL增至0.3 mg/mL时，颗粒粒径会随之增加，表面电位则随之下降。Liu等[8]指出CS亚微米颗粒包覆环丙沙星时，在pH 4.8下CS与TPP浓度分别为2 mg/mL与1 mg/mL时可得粒径约为300 nm的微纳颗粒，且固定CS浓度并提高TPP浓度时可降低颗粒粒径。

由以上文献可得知，CS亚微米颗粒已被广泛应用在药物、蛋白质或基因上，而其特性会受到许多因素的影响，因此本文将利用动态光散射法详细探讨CS分子量、分离大豆蛋白质水解物浓度及CS/TPP质量比等因素对CS-ISPH-TPP亚微米颗粒的粒径与表面电位的影响。

1基本原理

在动态光散射中，散射光强自相关函数强度G(2)(τ)与电场自相关函数g(1)(τ)之间满足Siegert关系：

(1)

其中β为相干因子，τ为延迟时间。对单分散球形颗粒而言，其电场自相关函数为

(2)

则光强自相关函数可改写为

(3)

其中Г为半宽衰减系数，它与平移扩散系数D之间满足

(4)

其中k为散射矢量，且有k=[4π sin(θ/2)]/λ。利用Stocks-Einstein公式可计算出悬浮颗粒的平均流体力学半径R，即

(5)

其中kB为玻尔兹曼常数，T为热力学温度，η为溶剂的黏滞系数。通过式(5)由平移扩散系数D就可以反演出流体力学半径R。

进行界面电位测量时，特定电压下带电粒子因静电吸引力而朝相反电性的电极移动，由于黏滞力会抑制带电粒子移动，当这两种力达到平衡时，带电粒子会以固定速度移动。该速度与电场强度、溶液的介电常数、黏度及界面电位有关，利用动态光散射可测得该移动速度的大小。当电场强度、溶液的介电常数及黏度已知时，即可根据Henry方程求得界面电位，即

(6)

其中μE为电泳移动率，ε为溶液的介电常数，ξ为颗粒的Zeta电位，η为溶液粘度，f(cR)为分散颗粒的参数。若分散颗粒为球形，且当cR很小时，则有

影像学检查 包括超声、核素显像、CT、磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)等，超声检查目前是评估甲状腺结节的首选方法。

(7)

而当cR非常大时，则有

(8)

2实验

表1给出了不同影响因素下所需CS-ISPH-TPP亚微米颗粒的配制方式，具体制备流程为：将1 mL大豆分离蛋白水解物(isolated soy protein hydrolysate，ISPH)溶液加至5 mL浓度为2 mg/mL几丁聚糖(CS)溶液(pH 4.7)中搅拌10 min，再将其缓慢滴入2 mL三聚磷酸钠(TPP)溶液(pH 9.0)搅拌15 min，使得混合液中CS/TPP质量比为6∶1，之后添加20 μL甘油搅拌5 min以避免纳米颗粒互相黏附，最后在15 ℃下以48 000g转速离心30 min后即得CS-ISPH-TPP亚微米颗粒。

表1　不同影响因素下所需CS-ISPH-TPP亚微米颗粒的配制方式

使用激光光散射法粒径及界面电位分析仪(Zetasizer 3000HS，Malvern，UK)测定亚微米颗粒的尺寸与表面电位。将CS-TPP与CS-ISPH-TPP亚微米颗粒悬浮于去离子水中，用超声波细胞粉碎机将聚集颗粒震碎，静置10~15 min后取上层溶液，以动态光散射法测定粒径大小；将CS-TPP与CS-ISPH-TPP亚微米颗粒以去离子水稀释至适当浓度，测定其表面电位。所有样品皆在室温下测定3次，求其平均值。

3结果与讨论

3.1　ISPH浓度的影响

图1　 ISPH浓度对CS-ISPH-TPP亚微米颗粒粒径的影响

图1表示的是ISPH浓度对CS-ISPH-TPP亚微米颗粒粒径的影响。可以看出，随着ISPH浓度的增加，CS-ISPH-TPP亚微米颗粒的粒径有变大的趋势，这是由于CS-TPP包覆了更多ISPH的缘故。

CS上的NH3+可提高其对肠黏膜的吸附力及可暂时性打开肠黏膜上紧密连接的能力，有利于药物、营养物质等渗透吸收。表2给出了ISPH浓度对CS-ISPH-TPP亚微米颗粒表面电位的影响。数据显示，随着ISPH浓度的增加，CS-ISPH-TPP亚微米颗粒的表面电位并无明显改变，颗粒表面均带正电荷，介于42.1~43.7 mV之间。这是因为在酸溶液中，CS上的NH2被质子化形成NH3+，此时将CS溶液滴入带负电的TPP溶液中会中和反应产生CS亚微米颗粒，而在颗粒表面上仍存在正电荷及未与TPP离子形成相互作用的NH3+。Gan等[6]指出当亚微米颗粒包覆BSA后表面电位只有轻微的减少，这是因为CS链上尚有许多游离的胺基并未被BSA占据，因此蛋白质吸附于CS表面并不会改变其分子表面电位。

表2　ISPH浓度对CS-ISPH-TPP亚微米颗粒表面电荷的影响

3.2　CS分子量的影响

图2表示的是CS分子量对CS-TPP与CS-ISPH-TPP亚微米颗粒粒径的影响。可以发现，CS-TPP与CS-ISPH-TPP亚微米颗粒的粒径随着CS分子量的增加而增大，且包覆有ISPH者的粒径均大于未包覆者的粒径。这是由于CS分子量越大，其链越长，因此链与链之间的立体空间障碍增大，所以亚微米颗粒粒径较大。Wu等[4]研究指出随着CS分子量的增加，其粒径有随之增大的趋势；而比较分子量为200 kDa与24 kDa的CS包覆不同浓度的甘草酸铵时，指出当以分子量200 kDa的CS包覆甘草酸铵时，颗粒粒径会随甘草酸铵浓度增加而增加，但以24 kDa的CS包覆甘草酸铵时，其颗粒粒径增加并不明显，这是由于低分子量的CS具有较高的溶解性，有助于亚微米颗粒胶体在溶液中的稳定。

图2　 CS分子量对CS-ISPH-TPP亚微米颗粒粒径的影响

表3　 CS分子量对CS-TPP与CS-ISPH-TP亚微米颗粒表面电位的影响

3.3　CS/TPP质量比的影响

图3表示的是CS/TPP质量比对CS-ISPH-TPP亚微米颗粒粒径的影响。由图可知，亚微米颗粒的粒径会受CS/TPP质量比影响而改变。当CS的分子量为固定值131.1 kDa，CS/TPP质量比由6∶1减至4∶1时，颗粒粒径会随之增加。这是由于TPP含量增加，几丁聚醣的胺基与TPP产生键结机会变多，能形成更多的网状结构，因此粒径会增大。而当CS/TPP的质量比由4∶1减至2∶1时，其粒径则呈现变小的趋势。这是由于TPP含量增加CS链上的胺基几乎都键结上TPP，因此CS上链与链之间的斥力降低，立体空间障碍变少，因此粒径变小。另外，包覆ISPH的颗粒粒径皆大于未包覆的颗粒，这是因为ISPH被键结或包覆进CS-TPP亚微米颗粒中的缘故。Grenha等[5]指出CS/TPP质量比由3.6∶1增至6∶1制备颗粒时，其粒径随之增加(300~390 nm)，他们认为这是由于CS与TPP之间键结增加的缘故；而CS/TPP质量比为6∶1与5∶1包覆胰岛素时，包覆胰岛素的颗粒粒径均大于未包覆的颗粒，这是由于胰岛素被包覆到其结构中所致。Gan等[3]使用3种不同分子量的CS对不同比例的TPP制备亚微米颗粒(CS/TPP质量比为3∶1~7∶1)，指出颗粒粒径会随CS分子量增加及CS/TPP质量比增大而增大(100~250 nm)。本研究结果与文献结果略有差异，笔者认为TPP含量增加会使CS的网状结构变多，同时导致颗粒粒径增加，故增加CS/TPP质量比(5∶1与6∶1)也有可能使颗粒粒径变小。

图3　 CS/TPP质量比对CS-ISPH-TPP亚微米颗粒粒径的影响

表4给出了CS/TPP质量比对CS-TPP与CS-ISPH-TPP亚微米颗粒表面电位的影响。表中显示，CS/TPP质量比由6∶1减至3∶1时，其表面电位虽有微小差异，但颗粒表面皆带有高度的正电荷(未包覆42.6~46.7 mV，包覆43.7~47.6 mV)。当CS/TPP质量比减至2∶1时，未包覆及包覆ISPH的颗粒表面电位均出现骤降的情形(未包覆颗粒，由46.7 mV减至26.6 mV；包覆ISPH的亚微米颗粒，由47.6 mV减至24.0 mV)，这是由于CS/TPP质量比减少至2∶1时，TPP含量大幅增加，故TPP易与CS链上的胺基产生键结，使CS的NH3+部位变少，表面电位降低。许多文献皆指出CS-TPP亚微米颗粒的表面电位会受TPP的浓度及包覆物质浓度等因素影响而降低：Grenha等[5]指出CS/TPP质量比由6∶1减至3.6∶1所制备亚微米颗粒的表面电位会由45 mV减至34 mV，当CS-TPP颗粒包覆胰岛素后其表面电位也会降低；Gand等[3]指出CS/TPP质量比由7∶1减至3∶1时表面电位随之递减，约由45 mV减至30 mV；Liu等[8]也指出随着TPP浓度的增加(0.75~1.75 mg/mL)，所得微米颗粒的表面电位均有随之下降的趋势(约由45 mV减至32 mV)。但本研究发现，当CS/TPP质量比减少至2∶1时，未包覆及包覆ISPH的颗粒表面电位均会出现骤降的情形。这一特性会影响CS的生物特性(如生物黏着性)及其对肠道上皮细胞的紧密连接调控的能力，故本文认为在制备CS-ISPH-TPP纳米颗粒时CS/TPP重量不宜低于3∶1。

表4　CS/TPP质量比对CS-TPP与CS-ISPH-TPP亚微米颗粒表面电位的影响

4结论

本研究分析了ISPH浓度、CS分子量及CS/TPP质量比对CS-ISPH-TPP亚微米颗粒的粒径与表面电位的影响。结果表明：

(1)用低分子量的CS与CS/TPP质量比6∶1包覆不同浓度(1~9 mg/mL)的ISPH时，所得亚微米颗粒的粒径随ISPH添加浓度的增加而增大，而表面电位则无明显变化。

(2)用固定浓度但分子量不同的ISPH与CS/TPP质量比为6∶1制备亚微米颗粒时，所得CS-TPP与CS-ISPH-TPP亚微米颗粒的粒径会随CS分子量增加而增大，且包覆ISPH颗粒的粒径均大于未包覆的颗粒，而表面电位则无明显变化。

(3)用低分子量的CS，固定ISPH溶液浓度，不同CS/TPP质量比制备亚微米颗粒时，CS/TPP质量比由6∶1减至4∶1时，颗粒粒径会随之增加；而由4∶1减至2∶1时，粒径则呈现变小的趋势；由6∶1减至3∶1时，颗粒表面均带有高度的正电荷，而减至2∶1时，颗粒表面电位会出现骤降的情形。

[参考文献]

[1]KO J A,PARK H J,HWANG S J,et al.Preparation and characterization of chitosan microparticles intended for controlled drug delivery[J].International Journal of Pharmaceutics,2002,249(1/2):165-174.

[2]XU Y,DU Y.Effect of molecular structure of chitosan on protein delivery properties of chitosan nanoparticles[J].International Journal of Pharmaceutics,2003,250(1):215-226.

[3]GAN Q,WANG T,COHRANE C,et al.Modulation of surface charge, particle size and morphological properties of chitosan-TPP nanoparticles intended for gene delivery[J].Colloids and Surfaces B:Biointerfaces,2005,44(2/3):65-73.

[4]WU Y,YANG W,WANG C,et al.Chitosan nanoparticles as a novel delivery system for ammonium glycyrrhizinate[J].International Journal of Pharmaceutics,2005,295(1/2):235-245.

[6]GAN Q,WANG T.Chitosan nanoparticle as protein deliverycarrier-systematic examination of fabrication conditions for efficient loading and release[J].Colloids and Surfaces B:Biointerfaces,2007,59(1):24-34.

[7]JANG K I,LEE H G.Stability of chitosan nanoparticles for L-Ascorbic acid during heat treatment in aqueous solution[J].Food Chemistry,2008,56(6):1936-1941.

[8]LIU Hui,GAO Chang-you.Preparation and properties of ionically cross-linked chitosan nanoparticles[J].Polymers for Advanced Technologies,2009,20(8):613-619.

[9]娄本浊.包覆染料木黄酮纳米胶囊的动态光散射研究[J].激光与光电子学进展,2013,50(10):147-151.

[10]XIA Hui,XIAO Yuan-yuan,HUANG Hao,et al.Particle sizing of colloidal suspensions by low-coherence fiber optic dynamic light scattering[J].Journal of Colloid and Interface Science,2012,367(1):527-530.

[责任编辑：魏 强]

Study on the influence factors of particle size and zeta potential of CS-ISPH-TPP submicron particles

LOU Ben-zhuo

(School of Physics and Telecommunication Engineering, Shaanxi University of Technology,Hanzhong 723000, China)

Abstract:CS-ISPH-TPP nanoparticles were prepared by isolated soy protein hydrolysate being coated through ionic crosslinking between chitosan hydrolysate(CS) with negative charge and sodium tripolyphosphate(TPP) with positive charge. The effects of ISPH concentration, chitosan molecular weight and CS/TPP mass ratio on the size and zeta potential of these nanoparticles were investigated by dynamic light scattering method. The results showed that, the size of CS-ISPH-TPP nanoparticles increased with ISPH concentration increasing and there was no obvious change in zeta potential. The size of CS-TPP and CS-ISPH-TPP nanoparticles increased with chitosan molecular weight increasing and zeta potential lied during 41.9~44.2 mV. The size of CS-TPP and CS-ISPH-TPP nanoparticles increased for CS/TPP mass ratio decreasing from 6∶1 to 4∶1 and decreased for CS/TPP mass ratio decreasing from 4∶1 to 2∶1. The surface of CS-TPP and CS-ISPH-TPP nanoparticles possessed a high degree of positive charge for CS/TPP mass ratio decreasing from 6∶1 to 4∶1 and the zeta potential decreased rapidly for CS/TPP mass ratio decreasing from 4∶1 to 2∶1.

Key words:dynamic light scattering;CS-ISPH-TPP;submicron particle;particle size;zeta potential